[0046] 将上述 pCHOl. 0 (anti-HER2/PS)、pCHOl. 0 (HER2-Fc)、pCHOl. 0 (anti-HER2)和 pCHOl. 0 (anti-PS)载体分别瞬时转染至人胚胎肾细胞293细胞系(购自：ATCC公司），培养 数天后，利用Protein A亲和层析柱(购自Pharmacia公司）从细胞培养上清中纯化抗体蛋 白。蛋白的定量通过BCA (Bicinchoninic acid)方法进行。纯化得到的抗HER2/PS双特异 性抗体、Trastuzumab和Bavituximab抗体样品用于以下的进一步分析与研究。
[0047] 实验例2SDS-PAGE和Western-blot检测抗HER2/PS双特异抗体
[0048] 纯化后的抗HER2/PS双特异抗体、Trastuzumab和Bavituximab均分别在非还 原（6%)和还原（12%)条件下用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测其纯度和分子量大小，同时通过 Western-blot进一步鉴定其性质和分子量。Western-blot方法如下：将电泳后的胶通 过电转移的方法转移至PVDF膜上，封闭后加入HRP标记的羊抗人IgG (H+L)，PBST洗两 遍，最后DAB法显色。聚丙烯酰氨凝胶电泳和Western-blot的结果显示：在还原条件下， Trastuzumab和Bavituximab均呈现为分子量大小约50KDa和25KDa的重链和轻链，而本 发明的抗HER2/PS双特异抗体呈现为分子量大小约63KDa (重链）和36KDa (轻链)。在非 还原条件下，所有抗体均呈现一条带，它们的大小分别为149KDa (Trastuzumab)，148KDa (Bavituximab)和192KDa (抗HER2/PS双特异性抗体)。同时，在非还原条件下，利用抗Fe 抗体或者抗κ抗体(均购自：Sigma)，并未检测到有异常分子碎片的存在(如单独重链，单 独轻链，或者重链复合物等)。
[0049] 实施例3抗HER2/PS双特异抗体与HER2结合能力的鉴定
[0050] 抗HER2/PS双特异抗体与HER2的结合通过Biacore3000进行检测。将表达纯化 的HER2-FC以不同浓度包被在Biac〇re3000的芯片上后，检测其亲和力。抗HER2/PS双特 异性抗体对HER2的亲和力与其母抗体Trastuzumab相似，具体见表1。
[0051] 表1，抗HER2/PS双特异性抗体对HER2的亲和力
[0052]
[0053] 抗HER2/PS双特异性抗体对HER2的体外生物学活性通过乳腺癌细胞株BT-474的 增殖实验进行检测。BT-474细胞(购自中国科学院典型培养物典藏委员会细胞库)。细胞复 苏后以RPMI1640完全培养基培养至对数生长期，以6X IO4Ail的密度制备成单细胞悬液， 100 μ 1/孔接种到96孔板中，同时，加入同样体积不同浓度稀释的抗HER2/PS双特异性抗 体和Trastuzumab (10ng/ml~100ng/ml)，每个浓度梯度设置3个复孔。培养7天后，利用 MTT方法检测细胞的增殖。实验结果如图3所示，本发明的抗HER2/PS双特异性抗体抑制 HER2介导的BT-474细胞的增殖与母抗体Trastuzumab相当。
[0054] 实施例4抗HER2/PS双特异性抗体对PS靶标的识别
[0055] 抗HER2/PS双特异性抗体与PS的亲和力通过ELISA进行检测。在PS(购自Sigma 公司）包被的96孔板中分别加入不同浓度（0. 016nM-33nM)的抗HER2/PS双特异性抗体和 8&"加^111&13,371：孵育2小时，然后利用山羊抗鼠186-!11^进行结合反应，371：孵育1小 时，加入TMB显色液37°C反应10分钟，然后用2MH2S04终止显色，测~9(|值。实验结果如图 4所示，抗HER2/PS双特异抗体与母抗体Bavituximab对PS的结合能力相当。抗HER2/PS 双特异抗体与母抗体Bavituximab相比整体结构已改变，但其并没有影响抗HER2/PS双特 异抗体对PS抗原表位的识别。
[0056] 实施例5抗体基因在CHO细胞中的表达
[0057] 通过脂质体法将pCHOl. 0 (anti_HER2/PS)载体转染至CHO-S细胞系（Life technologies公司产品），然后用嘌呤霉素和甲胺蝶呤筛选阳性细胞克隆。利用人IgG ELISA检测培养液上清中抗体浓度：5 μ g/ml的羊抗人IgG Fc抗体(购自Sigma)包被于 ELISA板，4°C过夜，2%牛血清白蛋白37°C封闭2小时。加入培养液上清或标准品（人IgGl) 37°C孵育2小时，利用HRP-羊抗人IgG (PIERCE)进行检测。将筛选得到的高表达克隆用 无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱分离纯化抗HER2/PS双特异性抗体。
[0058] 实施例6抗HER2/PS双特异抗体的ADCC效应
[0059] 抗HER2/PS双特异抗体的HER2介导的ADCC效应通过BT-474细胞系进行测定。 I. 5X 104BT-474细胞(购自中国科学院典型培养物典藏委员会细胞库）在96孔板中与不同 浓度（7. 8ng/ml~64μ g/ml)的双特异抗体孵育10分钟，母抗体Trastuzumab作为对照。效 应细胞外周血单个核细胞通过Ficoll密度梯度离心分离自新鲜人外周血，并以3X IO5/孔 的浓度加入至实验孔。37°C孵育4小时后通过乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase, LDH) 细胞毒性检测试剂盒（Promega公司产品）检测杀伤情况。结果如图5所示，本发明的 抗HER2/PS双特异性抗体保持了其母抗体Trastuzumab的ADCC活性，其细胞杀伤能力与 Trastuzumab无显著性差异。由于PS主要表达在凋亡细胞上，因此，针对PS靶点的ADCC实 验将无法区分是细胞自身的凋亡还是ADCC效应引起的凋亡，而且此双特异抗体以HER2母 抗体而不是PS母抗体的Fc片段为其Fc，现有对照将无法客观评价双特异抗体结构改变对 针对PS靶点的ADCC效应的变化。基于以上原因，我们没有进行针对PS靶点的体外ADCC 实验。
[0060] 实施例7人乳腺癌细胞系BT-474的异种移植模型
[0061] 生长状态良好的BT-474细胞(购自中国科学院典型培养物典藏委员会细胞库）用 0. 25% (w/v)胰蛋白酶和0. 02%EDTA短暂消化，洗涤重悬后以IX IO6细胞/鼠接种于6-8 周雌性裸鼠的右侧皮下。当肿瘤长至> 200mm3时，将30只肿瘤大小比较一致的荷瘤裸鼠随 机分成五组，开始给予抗HER2/PS双特异抗体治疗，无关同型抗体IgGl (购自Sigma公司）、 Trastuzumab、Bavituximab、Trastuzumab+Bavituximab 作为对照。五种抗体均以 10mg/kg， 每周一次静脉注射的方式进行给药。小鼠治疗开始后连续观察六周，每周测量肿瘤体积，肿 瘤体积大小的计算方式为：V=O. 5ab2。a为肿瘤实体最长直径，b为肿瘤实体最短直径。实 验结果如图6所示，与Trastuzumab+Bavituximab联合用药类似，本发明的抗HER2/PS双 特异性抗体治疗组完全阻断了肿瘤的进一步生长，小鼠肿瘤体积显著小于Trastuzumab或 Bavituximab 组。
【主权项】
1. 一种重组抗HER2/PS双特异性抗体，其特征在于所述抗体既能与HER2结合，还能与 PS结合。2. 权利要求1所述重组抗HER2/PS双特异性抗体，其特征在于，所述抗体可变区氨基酸 序列包含抗HER2单克隆抗体的可变区和抗PS单克隆抗体可变区氨基酸序列。3. 权利要求2所述重组抗HER2/PS双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体重链 可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示。4. 权利要求3所述重组抗HER2/PS双特异性抗体，其特征在于，所述抗体重链氨基酸序 列如SEQ ID NO:2所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。5. -种分离的核酸分子，其编码上述1-4任一所述抗HER2/PS双特异性抗体，所述核酸 分子可以是其重链核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。6. -种载体,其含有权利要求5所述的核酸分子，所述载体可以为pDRl，pcDNA3. 1( + )， pDHFF 或 pCHOL 0。7. -种宿主细胞，其含有权利要求6所述的载体，所述细胞可以为C0S、CH0、NS0、sf9、 sf21、DH5a、BL21(DE3)、TGl 之一。8. -种制备权利要求1-4任一所述抗HER2/PS双特异性抗体的方法，所述方法包括以 下步骤： a) 在表达条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，从而表达抗HER2/PS双特异性抗 体； b) 分离或纯化a)所述的抗HER2/PS双特异性抗体。9. 一种组合物，含有上述1-4任一所述的抗HER2/PS双特异性抗体和药学上可接受的 载体。10. 权利要求1-4任一所述的抗HER2/PS双特异性抗体或权利要求9所述制剂在制备 抗实体瘤药物中的用途；所述用途还可以包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种重组抗HER2/PS双特异性抗体、其制备方法和应用。本发明的抗HER2/PS双特异性抗体既能与HER2结合，还能与PS结合，本发明的双特异性抗体具有良好的抗肿瘤效果。
【IPC分类】C12P21/02, C12N5/10, C12N15/85, C12N15/13, A61K39/395, C07K16/46, A61P35/00
【公开号】CN104974261
【申请号】CN201410129991
【发明人】朱玲巧, 张成海, 赵杰, 郭锦林, 李致科
【申请人】上海中信国健药业股份有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月1日