抗vegf/pigf双特异性抗体、其制备方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种能同时与两种不同靶点 相结合的双特异性抗体、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用。
【背景技术】
[0002] 新生血管生成在肿瘤的发生发展过程中发挥着十分重要的作用。当肿瘤的体积超 过Imm3时，依靠组织渗透所获得的营养不能够支撑肿瘤继续发展对于营养的需求。因此， 肿瘤组织需要通过新生血管的生成来获取其发展所需要的各种养分。处于缺氧以及营养缺 乏状态的肿瘤细胞会分泌多种促新生血管生成的因子，如血管内皮生长因子（VEGF)，成纤 维细胞生长因子（FGF)，人胎盘生长因子（PIGF)，肿瘤坏死因子-α (TNF-α)等。在这些 生长因子的作用下，通过一系列复杂的过程，包括血管内皮基质的降解、内皮细胞的迁移、 内皮细胞增殖、管道化分支形成血管环和新的基底膜等步骤来形成新的血管。由于新生血 管生成在肿瘤发生发展中的重要性，通过抑制肿瘤的新生血管生成来抑制肿瘤的生长已经 成为当今肿瘤临床治疗的重要手段。
[0003] 在肿瘤细胞分泌的各种促新生血管生成的生长因子中，VEGF是公认的针对内皮细 胞特异性最高，促血管生长作用最强的有丝分裂原。VEGF与血管内皮细胞上的两种高亲和 力受体VEGFRl和VEGFR2结合后，直接刺激血管内皮细胞增殖，并诱导其迁移和形成管腔样 结构；同时还可增加微血管通透性，引起血浆蛋白（主要是纤维蛋白原）外渗，并通过诱导间 质产生而促进体内新生血管生成。VEGF在血管发生和形成过程中起着中枢性的调控作用， 是关键的新生血管生成刺激因子。
[0004] 目前，Genetech公司开发的针对VEGF的特异性单克隆抗体Bevacizumab (Avastin)在临床治疗中已经取得积极效果，被美国FDA批准其与化疗药物联合用于转移 性结肠癌、肺癌以及神经胶质瘤等肿瘤疾病的治疗。但是由于肿瘤细胞所分泌的促血管新 生因子的多样性，以及相关的各种因子在功能上具有一定的可替代性，因此通过抑制单个 促血管新生因子如VEGF的活性并不能完全阻断肿瘤内的新生血管的生成。临床前动物实 验表明，肿瘤组织在经过Bevacizumab处理后，组织内的其他促血管新生因子如PIGF，血管 生成素 _l(angiopoietin_l)，FGF 的表达量显著上升，（Casanovas 0, Hicklin DJ, Bergers G，Hanahan D. Drug resistance by evasion of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic islet tumors. Cancer Cell2005;8:299-309. )〇 此外，临床试验也进'一*步证明，在结肠癌患者中，经过抗VEGF的治疗后，患者体内的PIGF 水平显著升高（Willett CG，Boucher Y，Duda DG，di Tomaso E，Munn LL，et al. Surrogate markers for antiangiogenic therapy and dose-limiting toxicities for bevacizumab with radiation and chemotherapy: continued experience of phase I trial in rectal cancer patients. J Clin 0ncol2005;23:8136_9)。
[0005] 与VEGF不同的是，PIGF选择性地与VEGFRl以及它的辅助受体神经毡蛋 白-l(neuropilin-l)和神经毯蛋白-2 (neuropilin-2)相结合，并且在巨嗤细胞、骨髓 前体细胞的表面表达大量的VEGFR1。功能上，PIGF除了能够刺激内皮细胞的增殖、迁移 外，还能够通过趋化作用招募巨噬细胞和髓系前体细胞进入肿瘤组织，在肿瘤组织内形成 一个有利于血管新生的微环境。依赖PIGF所招募的巨噬细胞以及相关髓系细胞在肿瘤 组织新生血管生成的过程中发挥了重要的作用。研究表明，侵润进入肿瘤组织的巨噬细 胞在相关微环境中被诱导成M2型巨噬细胞。与Ml型巨噬细胞主要起激活机体特异性免 疫应答的作用不同，M2型巨噬细胞能够大量合成和释放各种抗炎细胞因子如白介素-10 (IL-10)、肿瘤生长因子-β (TGF-β )等、免疫抑制因子以及多种促进肿瘤生长的细胞因 子，从而抑制炎症反应和促进肿瘤细胞生长与转移。通过氯膦酸盐脂质体（clodronate liposomes)或抗PIGF抗体去除侵润肿瘤组织的巨噬细胞后，组织内的血管新生和肿瘤的 生长被显著抑制。此外，临床前动物体内实验证明，在对抗VEGF抗体耐受的移植瘤模型中， 抗PIGF抗体和抗VEGF抗体联用能够显著增强抗VEGF抗体的体内抗肿瘤作用（Fischer Cj Jonckx Bj Mazzone M，Zacchigna Sj Loges S，et al.Anti-PIGF inhibits growth of VEGF(R)-inhibitor-resistant tumors without affecting healthy vessels. Cell2007; 131:463-75)。但是在临床实践中，一方面，由于联合应用两种抗体造价太高，且 可用于组合治疗的抗体数目有限，另一方面，临床上两种不同靶向抗体药物进行联合治疗 在安全性方面存在着诸多风险。
[0006] 因此，构建一个能够同时与VEGF和PIGF相结合的双特异性抗体，进而更有效地抑 制肿瘤生长，一直是本领域的技术人员急待解决的问题。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述问题，本发明的发明人进行了大量试验，得到了一个可以同时阻断 VEGF和PIGF两个靶点的双特异性抗体，即本发明所述的"重组抗VEGF/PIGF双特异性抗 体"，从而完成了本发明。
[0008] 具体地，本发明公开了：
[0009] 1、一种抗VEGF/PIGF双特异性抗体，其特征在于，所述抗体既能与VEGF结合，又能 与PIGF相结合。
[0010] 2、上述1所述抗VEGF/PIGF双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体氨基酸 序列包含抗VEGF单克隆抗体的可变区和抗PIGF单克隆抗体的可变区序列。
[0011] 3、上述1或2所述抗VEGF/PIGF双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体轻 链可变区氨基酸序列为SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:8所示，所述双特异性抗体重链可变区 氨基酸序列为SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12所示。优选地，
[0012] 所述双特异性抗体还包括恒定区，且其轻链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO:2所 示，重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID N0:4所示。
[0013] 4、一种分离的核酸分子，其编码上述1-3任一所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体。 优选地，所述核酸分子编码所述双特异性抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO: 7所示，编码所述双特异性抗体重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 11 所示。
[0014] 5、一种表达载体，含有上述4所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相 连的表达调控序列；优选的，其所述载体可以为pCHOl. 0、pDRl、pcDNA3. 1 ( + )、pcDNA3. 1/ ZEO(+)或 pDHFR。
[0015] 6. -种宿主细胞，含有上述5所述的载体。优选的，所述宿主细胞为真核细胞。优 选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。最优选的，所述宿主细胞为CHO细胞。7、一种制备上 述1-3任一所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体的方法，所述方法包括步骤：
[0016] a)在表达条件下，培养上述6所述的宿主细胞，从而表达抗VEGF/PIGF双特异性抗 体，
[0017] b)分离或纯化所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体。
[0018] 8、一种组合物，含有上述1-3任一所述的抗体和药学上可接受的载体。
[0019] 9、上述1-3任一所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体或上述8所述的组合物在制备 抗肿瘤药物中的用途。
[0020] 10、上述9所述用途，还包括和其他的抗肿瘤药物联合使用。
[0021] 本发明中，任何能够同时和VEGF，P