stin) ;5、其他一些目前机制不明和有待进一步 研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的抗VEGF/PIGF双特 异性抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。
【附图说明】
[0034] 图I. pCHOL 0表达载体结构示意图，
[0035] 图2.抗VEGF/PIGF双特异性抗体结构示意图；
[0036] 图3.抗VEGF/PIGF双特异性抗体抑制HUVEC细胞增殖活性实验结果图；
[0037] 图4.抗VEGF/PIGF双特异性抗体对结肠癌HT-29移植瘤体内抗肿瘤作用实验结 果图；
[0038] 图5.抗VEGF/PIGF双特异性抗体对结肠癌Lovo移植瘤体内抗肿瘤作用实验结果 图；
【具体实施方式】
[0039] 以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为是对本发明的限 制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建抗体表达质粒的方法，将编码 蛋白的基因插入到相应的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法.这样的方法 对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括 Sambrook, J. , Fritsch, E. F. and Maniais, T. (1989) Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, 2ndedition, Cold spring Harbor Laboratory Press.
[0040] 实施例1.人抗体轻、重链恒定区基因的克隆
[0041] 用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂（Invitrogen公司产品） 提取总 RNA，根据文献（Cell, 1980, 22 :197-207)和文献（Nucleic Acids Research，1982， 10 :4071-4079)的报道，分别设计引物扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR反应均采用热 启动，反应条件：94°C分钟；94°C 45秒，60°C 45秒，72°C 1分10秒，30个循环；72°C 10分 钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体(购自Life Technology公 司，以下同）中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2分别显 示了轻链恒定区（CL)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4分别显示了重 链恒定区（CH)的核苷酸和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CL和pGEM-T/CH。
[0042] 实施例2.抗VEGF/PIGF双特异性抗体表达载体的构建
[0043] 轻链VLl (来自抗VEGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No. 7)、VL2(来自抗PIGF抗体，核 苷酸序列SEQ ID No. 5)，重链VHl (来自抗VEGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No. 11)、VH2(来 自抗PIGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No. 9)的核苷酸序列由上海生物工程技术服务有限公 司全基因合成。轻链VLl与VL2核苷酸序列通过overlapPCR的方法与Linkerl以串联形 式进行连接（Linkerl核苷酸序列见SEQ ID No. 13)，并且被克隆到pGEM-T载体。然后轻链 双变区基因（VL1-VL2)核苷酸序列与人抗体轻链恒定区核苷酸序列以overlapPCR连接被 克隆到pGEM-T载体中，挑选阳性克隆，测序正确。以AvrII和BstZ17I酶切，经琼脂糖凝胶 电泳纯化回收获得的酶切片断与同酶切的质粒pCHOl.O(购自Life Technology公司，以下 同)用T4DNA连接酶进行连接，构建成轻链表达载体pCH0(VEGF/PIGF DVD-IgG-L)。重链VHl 与VH2核苷酸序列通过overlapPCR的方法与Linker2以串联形式进行连接（Linker2核苷 酸序列见SEQ ID No. 15)，并且被克隆到pGEM-T载体。然后重链双变区基因（VH1-VH2)核 苷酸序列与人抗体IgGl重链恒定区核苷酸序列以overlapPCR连接被克隆到pGEM-T载体 中，挑选阳性克隆，测序正确。以EcoRV和Pacl酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得的酶 切片断与同酶切的轻链表达载体pCH0(VEGF/PIGF DVD-IgG-L)用T4DNA连接酶进行连接， 构建完整的VEGF/PIGF双特异性抗体表达载体pCH0(VEGF/PIGF DVD-IgG)。附图1展示了 pCHOl.O表达载体结构示意图。其中，PPGK是磷酸甘油酸激酶启动子；PEF2/CMV是EF2/CMV 杂合启动子，PCMV/EF1是CMV/EF1杂合启动子，SV40pA表示SV40多腺苷化信号；CMVpA表 示CMV多腺苷化信号，DHFR表示二氢叶酸还原酶基因；pac为嘌呤霉素抗性基因 ，pMBlori 为质粒复制起点。图2展示了获得的抗VEGF/PIGF双特异性抗体结构示意图，抗VEGF/PIGF 双特异性抗体轻链VLl-Iinker1-VI^-CL,重链VHl-I inker2-VH2-CH其中VLl，VHl分别为抗 VEGF/PIGF双特异性抗体轻、重链的第一可变区结构域；VL2, VH2分别为抗VEGF/PIGF双特 异抗体轻、重链的是第二可变区结构域；CL, CH分别为抗VEGF/PIGF双特异性抗体轻、重链 的恒定区；Iinker1, Iinker2分别是连接抗VEGF/PIGF双特异性抗体轻链、重链的第一和第 二可变区结构域的连接多肽，轻链VLl (来自抗VEGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No. 7,氨基酸 序列SEQ ID No. 8)，VL2(来自抗PIGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No. 5,氨基酸序列SEQ ID No. 6)，重链VHl (来自抗VEGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No. 11，氨基酸序列SEQ ID No. 12)， VH2 (来自抗PIGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No. 9,氨基酸序列SEQ ID No. 10)，轻链CL (核 苷酸序列SEQ ID No. 1，氨基酸序列SEQ ID No. 2)，重链CH (核苷酸序列SEQ ID No. 3,氨 基酸序列SEQ ID No. 4)。
[0044] 于125ml摇瓶中接种5 X IOVml CHO-S细胞30ml，细胞培养24小时后进行转染： 取 pCHO(VEGF/PIGF DVD-IgG)质粒 50yg 和 50μ1 FreeStyle?MAX Reagent (Invitrogen 公司产品）分别溶于I. 45ml OptiPRO?SFM，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵 育10分钟使形成DNA-脂质体复合物，将DNA-脂质体复合物加入到摇瓶中，再将转染后的 CHO-S细胞于37°C，8%C02于摇床培养箱中130-150rpm继续培养。转染进行48小时后用含 50 μ g/ml嘌呤霉素和1 μ M的甲氨喋呤的选择培养基筛选稳定表达抗VEGF/PIGF双特异性 抗体的单细胞克隆细胞。
[0045] 取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：小鼠抗人IgGl (CH2)包被于 ELISA板，4°C过夜，用2%BSA-PBS于37°C封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品（Human myeloma IgGl, κ)，37°C孵育2小时，加入HRP-小鼠抗人IgG(CH3)进行结合反应，37°C孵 育1小时，加入TMB于37°C作用5分钟，最后用H2SO4终止反应，测OD45tl值。将筛选得到的 高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱（GE公司产品）分离纯化VEGF/ PIGF双特异性抗体，经测序，和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10序列一致，将纯化的双特异性 抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。图2为双特异性抗体结构图。
[0046] 实验例
[0047] 实验例I. Biacore法检测抗VEGF/PIGF双特异性抗体与VEGF亲和力实验
[0048] 抗VEGF/PIGF双特异性抗体与VEGF (购自：R&D公司）的亲和力是根据用 BIAcore-2000?表面胞质团共振系统测得的结合速率常数和解离速率常数计算出的。用盐 酸N-乙基-Ν' -(3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC)和羟基琥珀酰亚胺将生物传感器 芯片CM5活化，以便于VEGF共价偶联。将VEGF的缓冲液换为20mM乙酸钠（ΡΗ4. 8)，然后 稀释至