约50微克/毫升。将一等份样品（35微升）以2微升/分钟的流速注入，以达到约 700-1400共振单位（RU)的偶联蛋白，然后注入IM乙醇胺作为封闭剂。对于抗VEGF/PIGF 双特异性抗体与VEGF亲和力检测，将抗VEGF/PIGF双特异性抗体或抗VEGF-抗体(按照实 施例2方法自行制备，以下同)在PBS/TWEEN ?缓冲液(含0. 05%TWEEN20?的磷酸盐缓冲液） 中的2倍系列稀释液，以10微升/分钟的速度注入，结合和解离速率用标准方法（Karlsson 等人，免疫学方法杂志（J. Immun. Methods )145:229-240 (1991))计算，平衡解离常数Kd (表 面胞质团共振（SPR)测量值的Kd)按1(。"/1("进行计算。数据见表1。如表1所示，抗VEGF/ PIGF双特异性抗体与抗VEGF抗体相比，具有十分相似的动力学常数，其与VEGF的结合平衡 解离常速Kd值为7 X KTiqM左右。
[0049]
[0050]
[0051] 实验例2.抗VEGF/PIGF双特异性抗体与PIGF亲和力检测实验
[0052] 抗VEGF/PIGF双特异性抗体与PIGF (购自R&D公司）的亲和力是根据用 BIAcore-2000?表面胞质团共振系统测得的结合速率常数和解离速率常数计算出的。用盐 酸N-乙基-Ν' -(3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC)和羟基琥珀酰亚胺将生物传感器 芯片CM5活化，以便于PIGF共价偶联。将PIGF的缓冲液换为20mM乙酸钠（ΡΗ4. 8)，然后 稀释至约60微克/毫升。将一等份样品（35微升）以2微升/分钟的流速注入，以达到约 700-1400共振单位（RU)的偶联蛋白，然后注入IM乙醇胺作为封闭剂。对于抗VEGF/PIGF 双特异性抗体与PIGF亲和力检测，将抗VEGF/PIGF双特异性抗体或抗PIGF-抗体(按照实 施例2方法制备得到）在PBS/TWEEN ?缓冲液(含0. 05%TWEEN20?的磷酸盐缓冲液）中的2 倍系列稀释液，以10微升/分钟的速度注入，结合和解离速率用标准方法（Karlsson等人， 免疫学方法杂志（J. Immun. Methods)145:229-240 (1991))计算，平衡解离常数Kd (表面胞 质团共振（SPR)测量值的Kd)按KtjffZXn进行计算。数据见表2。抗VEGF/PIGF双特异性抗 体和抗PIGF抗体具有十分相似的动力学常数，抗VEGF/PIGF双特异性抗体与PIGF的结合 力略低于抗PIGF抗体，结合平衡解离常速Kd值为8 X KT9M左右。
[0053]
[0054]
[0055] 实验例3.抗VEGF/PIGF双特异性抗体抑制HUVEC细胞增殖实验
[0056] 实验步骤：取生长状态良好的HUVEC细胞(购自中国科学院典型培养物典藏委员 会细胞库)，调整细胞浓度为2. 5X 104/ml，接种于96孔细胞培养板，100 μ 1/孔，于37°C、 5%C02孵箱中培养24h后换无血清培养基，继续培养24h，分别加入不同浓度梯度的VEGF/ PIGF DVD-IgG,抗VEGF抗体，抗PIGF抗体，以PBS为对照，每个浓度取3个平行孔，37°C 孵育lh，加入终浓度为50ng/ml的VEGF-A或100ng/ml的VEGF-C继续培养72h后，加入 100 μ 1/孔CellTiter (Promega公司产品）试剂，室温孵育15分钟后，96孔板的荧光值在 SpectraMax进行读数检测HUVEC细胞的增殖情况，计算不同处理组的相关抑制率。如图3 所示，结果表明VEGF/PIGF DVD-IgG,抗VEGF抗体，抗PIGF抗体可同时抑制VEGF-A引起 的HUVEC细胞增殖，且VEGF/PIGF DVD-IgG抑制VEGF-A引起的HUVEC细胞增殖的活性较抗 VEGF抗体和抗PIGF抗体强。
[0057] 实验例4.抗VEGF/PIGF双特异性抗体体内抑制HT-29移植瘤生长实验
[0058] 实验步骤：为评价VEGF/PIGF双特异性抗体的体内抗肿瘤作用，人结肠癌细胞 HT-29 (5 XlO6细胞/只）（购自中国科学院典型培养物典藏委员会细胞库，以下同）接种于 Balb/ca裸小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司，以下同）的右侧皮下，待裸小鼠的皮下 肿瘤长到100-200mm3时，对荷瘤裸小鼠进行随机分组，共分为四组：空白对照组，抗VEGF抗 体治疗组，抗PIGF抗体治疗组，抗VEGF/PIGF双特异性抗体治疗组。每三天进行尾静脉注 射给药一次，持续给药四周。每周测量肿瘤的长宽两次，计算相对肿瘤体积，结果如图4所 示。结果表明：在结肠癌HT-29移植瘤模型中，与抗VEGF抗体治疗组和抗PIGF抗体治疗组 相比，抗VEGF/PIGF双特异性抗体治疗组的肿瘤生长受到了更为显著地抑制，肿瘤体积明 显小于抗VEGF抗体治疗组和抗PIGF抗体治疗组，且与进行治疗的初始肿瘤体积相比，肿瘤 的体积显著缩小。
[0059] 实验例5. VEGF/PIGF双特异性抗体体内抑制LoVo移植瘤生长实验
[0060] 实验步骤：为评价抗VEGF/PIGF双特异性抗体的体内抗肿瘤作用，人结肠癌细 胞Lovo (5 X IO6细胞/只）接种于Balb/CA裸小鼠的右侧皮下，待裸小鼠的皮下肿瘤长到 100-200mm3时，对荷瘤裸小鼠进行随机分组，共分为四组：空白对照组，抗VEGF抗体治疗 组，抗PIGF抗体治疗组，抗VEGF/PIGF双特异性抗体治疗组。每三天进行尾静脉注射给药 一次，持续给药四周。每周测量肿瘤的长宽两次，计算相对肿瘤体积，结果如图5所示。结 果表明：在结肠癌Lovo移植瘤模型中，与抗VEGF抗体治疗组和抗PIGF抗体治疗组相比，抗 VEGF/PIGF双特异性抗体治疗组的肿瘤生长受到了更为显著地抑制，肿瘤体积明显小于抗 VEGF抗体治疗组和抗PIGF抗体治疗组。
【主权项】
1. 一种抗VEGF/PIGF双特异性抗体，其特征在于，所述抗体既能与VEGF结合，又能与 PIGF相结合。2. 权利要求1所述抗VEGF/PIGF双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体氨基酸 序列包含抗VEGF单克隆抗体的可变区和抗PIGF单克隆抗体的可变区序列。3. 权利要求2所述抗VEGF/PIGF双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体轻链可 变区氨基酸序列为SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:8所示，所述双特异性抗体重链可变区氨基 酸序列为SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12所示。4. 权利要求3所述抗VEGF/PIGF双特异性抗体，其轻链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO: 2所示，重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。5. -种分离的核酸分子，其编码上述1-4任一所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体。6. -种表达载体，含有上述5所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表 达调控序列；其所述载体可以为 pCHOL 0、pDRl、pcDNA3. I ( + )、pcDNA3. 1/ZE0(+)或 pDHFR。7. -种宿主细胞，含有上述5所述的载体。8. -种制备上述1-3任一所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体的方法，所述方法包括步 骤： a) 在表达条件下，培养上述6所述的宿主细胞，从而表达抗VEGF/PIGF双特异性抗体， b) 分离或纯化a)所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体。9. 一种组合物，含有上述1-3任一所述的抗体和药学上可接受的载体。10. 上述1-3任一所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体或上述8所述的组合物在制备抗 肿瘤药物中的用途，优选地，还包括和其他的，抗肿瘤药物联合使用。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，更具体的，本发明公开了抗VEGF/PIGF双特异性抗体、其制备方法及用途。本发明的抗VEGF/PIGF双特异性抗体既能与VEGF结合，又能与PIGF相结合，可有效抑制肿瘤内血管形成，进而更有效地抑制肿瘤生长。
【IPC分类】C12N5/10, C12P21/02, A61P35/00, C12N15/85, C12N15/13, C07K16/46, C07K16/22, A61K39/395
【公开号】CN104974259
【申请号】CN201410128464
【发明人】周远锋, 张成海, 张玉晶
【申请人】上海中信国健药业股份有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月1日