040]目标SNP筛选完成后，截取SNP上下游各500bp的片段，利用引物设计软件 Priemer 5.0进行引物设计。保证引物扩增片段含有目标SNP，引物长度在18~22bp之间， 退火温度55°C。共设计7对引物，引物序列如表2,序列表中序列编号为SEQ ID NO: 1~ SEQ ID NO: 14。所有引物设计完成后委托北京华大基因公司合成。
[0041] 表2弓丨物序列信息
[0042]
[0043] 5、目标片段PCR扩增
[0044] 用设计的7对引物扩增129、C3H、BALB、C57BL、CBA、DBA、FVB和ICR基因序列。
[0045] 基因组DNA提取参照普博欣生物科技有限公司生产制造的动物基因组DNA提取试 剂盒（离心柱法）的说明书进行操作。以上合成的引物进行短暂离心，加入无菌去离子水 充分溶解到浓度为10 μ M，室温静置30分钟，4°C保存。
[0046] 以每个动物样本的基因组DNA作为模板进行PCR反应，PCR反应体系（20 μ L)如 表3〇
[0047] 表3 PRC反应体系
[0048]
[0049] 混匀后短暂离心，放置至PCR仪上，设置循环程序为:
[0050]
[0051] 上述PCR反应产物进行I. 0 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0052] 称取0. 5g琼脂糖加到50mL TAE反应液中加热溶解，待温度降至60°C时，加入溴化 乙锭类似物3 μ L混匀，倒入插有2mm梳子的电泳槽内，等待凝固后使用。每孔加5 μ L PCR 产物，采用121V恒压，电泳15min后在紫外线透射仪下观察结果，目标条带全部单一明亮。
[0053] 所有扩增成功的PCR产物以4°C保存，直接进行DNA测序，全部测序工作由北京华 大基因公司测序部完成。
[0054] 6、测序序列分析
[0055] 6. 1测序序列拼接
[0056] 由于Sanger测序的序列起始端测序质量较低，准确性相对较差，采用正向引物和 反向引物分别进行测序，根据测序峰图，序列相互补充，拼接成完整的测序序列。8个近交系 通用的序列信息见序列表SEQ ID NO: 15~SEQ ID NO:21所示。
[0057] 6. 2PCR序列鉴定和SNP位点
[0058] 把测序得到的序列与原基因组上序列比对，通过与原始序列的Identity(同源 性）来确定用该引物PCR扩增得到的序列是否是目标序列，7对引物PCR产物测序结果与原 始基因组序列比对同源性都在99%以上，序列全部很好的比对回对应的基因组序列，并且 涵盖了目的SNP位点，见序列SEQ ID NO: 15~SEQ ID N0:21。表明设计的引物确实可以准 确的扩增出目标区域并涵盖目标SNP位点。
[0059] 7、采用质谱方法对不同近交系的7个SNP位点进行分型
[0060] 采用质谱法MassArray对广东省实验动物监测所、暨南大学和南方医科大学等单 位采集的小鼠近交系129、C3H、BALB、C57BL、CBA、DBA、FVB、ICR进行7个SNP位点的分型， 结果见表4。初步结果基本与预期一致，但也有少数样品不是预期结果。
[0061] 表4 SNP标记在实际小鼠近交系中的基因型
[0062]
[0063]一上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于小鼠近交系鉴定的SNP标记，其特征在于包括7个SNP位点，为SNPl、SNP2、 SNP3、SNP4、SNP5、SNP6 和 SNP7 ; 所述的SNPl表示该SNP位点位于SEQ ID NO : 15所示的核苷酸序列的第91位，并且该 位置处核苷酸序列为简并碱基K ; 所述的SNP2表示该SNP位点位于SEQ ID NO : 16所示的核苷酸序列的第196位，并且 该位置处核苷酸序列为简并碱基M ; 所述的SNP3表示该SNP位点位于SEQ ID NO : 17所示的核苷酸序列的第112位，并且 该位置处核苷酸序列为简并碱基R ; 所述的SNP4表示该SNP位点位于SEQ ID NO : 18所示的核苷酸序列的第294位，并且 该位置处核苷酸序列为简并碱基Y ; 所述的SNP5表示该SNP位点位于SEQ ID NO : 19所示的核苷酸序列的第188位，并且 该位置处核苷酸序列为简并碱基R ; 所述的SNP6表示该SNP位点位于SEQ ID NO :20所示的核苷酸序列的第244位，并且 该位置处核苷酸序列为简并碱基Y ; 所述的SNP7表示该SNP位点位于SEQ ID NO :21所示的核苷酸序列的第217位，并且 该位置处核苷酸序列为简并碱基Y。2. 根据权利要求1所述的用于小鼠近交系鉴定的SNP标记，其特征在于：所述的小鼠 近交系为129、0311、841^、05781、084、084、？￥8和10?中的至少一种。3. -种用于小鼠近交系鉴定的引物对，其特征在于：包括引物对SNP1F/R、引物对 SNP2F/R、引物对SNP3F/R、引物对SNP4F/R、引物对SNP5F/R、引物对SNP6F/R和引物对 SNP7F/R中的至少一对； 引物对SNP1F/R的序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示； 引物对SNP2F/R的序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4所示； 引物对SNP3F/R的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示； 引物对SNP4F/R的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示； 引物对SNP5F/R的序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10所示； 引物对SNP6F/R的序列如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示； 引物对SNP7F/R的序列如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示。4. 根据权利要求3所述的用于小鼠近交系鉴定的引物对，其特征在于：所述的小鼠近 交系为129、0311、841^、05781、084、084、？￥8和10?中的至少一种。5. 利用权利要求3或4所述的引物对扩增得到的DNA序列，其特征在于：所述的DNA序 列如 SEQ ID NO: 15 ~SEQ ID NO:21 所示。6. 权利要求1或2所述的SNP标记在小鼠近交系的鉴定中的应用。7. 权利要求1或2所述的SNP标记在制备试剂盒或检测方法中的应用，其特征在于： 所述的试剂盒或检测方法的用途为小鼠近交系鉴定或物种鉴定。8. 权利要求3或4所述的引物对在小鼠近交系的鉴定中的应用。9. 权利要求3或4所述的引物对在制备试剂盒或检测方法中的应用，其特征在于：所 述的试剂盒或检测方法的用途为小鼠近交系鉴定或物种鉴定。10. 权利要求5所述的DNA序列在辅助进行小鼠近交系或物种鉴定中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种用于小鼠近交系鉴定的SNP标记、引物对及其应用。利用筛出的7个SNP位点：SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6和SNP7，设计7对引物，序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:14所示；每对引物都能够在同样条件下扩增小鼠近交系的基因组序列，序列如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:21所示。且每对引物扩增出的序列都含有一个特定的SNP标记。SNP标记和引物对的应用可达到快速初筛和降低检测成本的目的，从而促进近交系小鼠遗传质量监测标准化进程。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104975105
【申请号】CN201510469373
【发明人】杜红丽, 关宇佳, 李舸, 张钰, 张燕宇
【申请人】华南理工大学, 广东省实验动物监测所
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年7月31日