H20 3 g/L、KH2PO4
0.5 g/L、酵母粉 11 g/L、MnSO4 0.1 g/L、KCl 0.1 g/L、FeSO4.7H20 0.18 g/L、MgSO4.7H20
0.1 g/L, 121 °C，灭菌 20 min;
发酵培养基配方为=(NH4)2SO4 6 g/L、葡萄糖 20 g/L、K2HPO4.3H20 3 g/L、KH2PO4 0.5g/L、酵母粉 11 g/L、MnSO4 0.1 g/L、KCl 0.1 g/L、FeSO4.7H20 0.18 g/L、MgSO4.7H20 0.1g/L, 121 °C，灭菌 20 min ；
补料配方为:葡萄糖500 g/L、酵母粉10 g/L、MgSO4.7H20 0.1 g/L。发酵过程中每小时观察，葡萄糖含量低于2 g/100 ml时立即补充，但葡萄糖含量不超过4 g/100 ml。
[0020]第三步，酵母干粉剂型的制备
将发酵液取出，在4 "€下4000 r/min离心10 min，去掉上清保留酵母菌体。选用鹿糖、糊精作为保护剂，将酵母菌体和保护剂充分混合均匀，用摇摆式颗粒机制成颗粒，置于真空干燥箱中干燥，制成干粉菌剂。其中，酵母菌体100 g、糊精300 g-400 g、蔗糖30 g-50 g。
[0021]本发明所提供的生防酵母菌的干粉制剂的应用方法，其是取干粉制剂，溶于水制成生防酵母菌悬浮液，将采后的水果置于酵母溶液中浸泡，让生防酵母菌在水果表面和伤口处迅速消耗掉营养并占领生存空间。
[0022]本实例中将制备成功的生防酵母菌干粉菌剂按照浓度100 g/L制成生防酵母菌悬浮液。本发明所使用的苹果为市场上常见的烟台富士苹果，取采后的健康苹果在1% (w/v)次氯酸钠中浸泡10 min，取出后用自来水冲洗干净，用灭菌的铁钉在每个苹果上打出三个小孔，将苹果分为实验组(油I组)和对照组，对照组伤口处接种无菌水10 μ I，实验组伤口处接种生防酵母菌菌液10 μ 1，静置30 min待其自然风干后，实验组和对照组均在苹果伤口处接种浓度为14 CFUs/ml的青霉菌孢子悬浮液10 μ I，之后将苹果放置在塑料筐中，在筐中放入用无菌水浸泡的医用棉球，用大的塑料袋将其封口。置于25 °C放置，每天观察并统计其发病情况。
[0023]图1是本发明制备出的生防酵母菌对于苹果青霉病在6 d时的抗病效果图。本发明使用的酵母菌株分离自水果油桃，命名uvarum Youtao-l，简称“油I”。从图1可以明显的对比出在接种青霉病6 d后，生防酵母悬浮液中浸泡过的苹果比未浸泡的苹果对于青霉病的抗病能力有明显的提高。
[0024]图2是本发明制备出的生防酵母菌对于苹果青霉病的抗病效果数据。从图2可以看出，在接种后4 d时，对照组的苹果创口处83%都发病了，而油I实验组有6%的发病；在接种后6 d时，对照组的苹果创口处100%发病且发病情况严重，病斑较大，油I实验组发病率为11%。实验结果说明了本发明的生防菌有着较好的生防效果，能够显著的增强苹果对于青霉病的抗病能力，减少采后青霉病造成的苹果产量损失。
[0025]图3是本发明制备出的生防酵母菌对于梨青霉病的抗病效果数据。其中抗病实验如下:
将制备成功的生防酵母菌干粉菌剂按照浓度100 g/L制成生防酵母菌悬浮液。本发明所使用的梨子为市场上常见的砀山梨，取采后的健康梨在1%次氯酸钠中浸泡10 min，取出后用自来水冲洗干净，用灭菌的铁钉在每个梨上打出三个小孔，将梨分为实验组和对照组，对照组伤口处接种无菌水10 μ 1，实验组伤口处接种生防酵母菌菌液10 μ 1，静置30 min待其自然风干后，实验组和对照组均在梨伤口处接种浓度为14 CFUs/ml的青霉菌孢子悬浮液10 μ 1，之后将梨放置在塑料筐中，在筐中放入用无菌水浸泡的医用棉球，用大的塑料袋将其封口。置于25 °C放置，每天观察并统计其发病情况。
[0026]从图3可以看出，在接种后4 d时，对照组的梨创口处86%都发病了，油I实验组有6%的发病；在接种后6 d时，对照组的梨创口处100%发病，病斑较大，油I实验组发病率为17%。实验结果说明了生防菌有着较好的生防效果，能够显著的增强梨对于青霉病的抗病能力，减少采后青霉病造成的梨产量损失。
【主权项】
1.一种生防酵母菌，从油桃中提取分离得到，保藏名称:Hanseniaspora u varumYoutao-1，保藏号 CCTCC NO:M2015287o2.权利要求1所述生防酵母菌的干粉制剂，采用下述方法步骤制备: (1)划线培养:用接种环沾取分离自油桃的生防酵母菌，在YPD固体培养基上划线，置于 25-30 °C 培养 20-24 h ； (2)种子培养:取步骤(I)培养的酵母菌株接种于种子培养基中，于25-30°C培养10-20 h ;所述种子培养基采用YPD液体培养基； (3)摇瓶种子培养:取1000μ I步骤(2)所得种子液接入500 ml种子摇瓶培养基中，25-30 °C下，180-220 r/min摇床培养20-24 h ;所述种子摇瓶培养基配方为:(NH4)2S04 6g/L、葡萄糖 35 g/L、K2HPO4.3H20 3 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、酵母粉 11 g/L、MnSO4 0.1 g/L、KCl 0.1 g/L、FeSO4.7H20 0.18 g/L、MgSO4.7H20 0.1 g/L, 121 °(:高温灭菌 20 min 制得； (4)发酵培养:将2500ml步骤(3)所得摇瓶种子加入到50 L发酵培养基中，搅拌速度为180-220 r/min，在25-30 °C下培养30-40 h ;所述发酵培养基配方为:(NH4) 2S04 6 g/L、葡萄糖 20 g/L、K2HPO4.3H20 3 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、酵母粉 11 g/L、MnSO4 0.1 g/L、KCl0.1 g/L、FeSO4.7H20 0.18 g/L、MgSO4.7H20 0.1 g/L, 121 °C 灭菌 20 min ； (5)干粉制剂:将发酵液取出，在3-60C, 3800-4200 r/min下离心8-12 min，去掉上清保留酵母菌体，将酵母菌体与保护剂搅拌混合均匀，制粒，真空干燥。3.如权利要求2所述生防酵母菌的干粉制剂，其特征在于:步骤(2)和步骤(3)还包括在无菌台取样镜检的步骤。4.如权利要求2所述生防酵母菌的干粉制剂，其特征在于:步骤(4)发酵过程中每小时测定糖含量，通过控制补料的进样量来保持发酵液的葡萄糖含量在2-4 g/100 ml之间，所述补料配方为:葡萄糖500 g/L、酵母粉10 g/L、MgSO4.7H20 0.lg/L。5.如权利要求2所述生防酵母菌的干粉制剂，其特征在于:步骤(5)所述保护剂为蔗糖和糊精，其中糊精为酵母菌体质量的2-4倍，蔗糖为酵母菌体质量的0.2-0.5倍。6.权利要求2-5任一项所述生防酵母菌的干粉制剂的应用，其特征在于:取干粉制剂，溶于水制成生防酵母菌悬浮液，将采后的水果置于酵母溶液中浸泡，让生防酵母菌在水果表面和伤口处迅速消耗掉营养并占领生存空间。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于:取干粉制剂，溶于水制成浓度为80-120g/L的生防酵母菌悬浮液，将采后的水果置于酵母溶液中浸泡20-40 min。8.如权利要求6所述的应用，其特征在于:所述水果为苹果、梨、猕猴桃、芒果或油桃。
【专利摘要】本发明公开了一种生防酵母菌，其是从油桃表面分离得到，保藏名称：<i>Hanseniaspora</i><i>？uvarum</i>？Youtao-1，保藏号CCTCC？NO：M2015287。本发明还公开了该生防酵母菌的干粉制剂及其应用。本发明所述生防酵母菌对青霉病有显著的生物防治效果，制备成干粉菌剂后方便贮藏和使用。本发明的生防酵母菌干粉菌剂按比例溶于水后浸泡水果能有效的增强水果对于青霉病的抗病能力。本发明所提供的制备方法还具有制备操作简单，制备成本较低，容易大规模生产的特点。CCTCC NO：M201528720150511
【IPC分类】C12N1/16, A01P3/00, A01N63/04
【公开号】CN105002100
【申请号】CN201510410972
【发明人】张晓静, 孙志强, 刘嘉, 刘永胜, 程哲, 李光伟, 迟孟山
【申请人】烟台绿云生物科技有限公司, 合肥工业大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月14日