我们进行了不同时间点的追踪，发现转染后10小 时，有无CCDC8，差别不大，但是随着时间延长，表达CCDC8时，越来越多的细胞内绿色HIV-1 Gag-GFP出现聚集（图5C，5D)。而且，从时间上看，先是绿色的Gag-GFP在细胞膜上，后来 才出现细胞内的聚集。我们又对细胞内Gag-GFP聚集的细胞进行了计数，大约在转染后16 小时达高峰，有(XDC8表达时，大约70%的细胞都出现了 Gag-GFP的细胞内聚集。而没有 (XDC8表达时，Gag-GFP细胞内聚集数量随时间没有明显变化（图5C，5D)。这一结果表明， HIV-1 Gag在细胞膜上遇到(XDC8,发生了改变，不是象正常一样出芽、释放，而是"内化"或 者"内吞"回细胞内。为进一步证实，我们在实验中加入了一个细胞内吞抑制剂（Dynamin K44A)。所有的细胞内吞都需要Dynamin的作用，将44位赖氨酸变为丙氨酸后（K44A)，则失 去活性，成为内吞抑制剂。结果表明，加入Dynamin K44A后，(XDC8引起的Gag-GFP细胞内 聚集降低了很多（图5E)，具有统计学意义，说明膜蛋白（XDC8引起了 HIV-1 Gag的内吞。
[0033] 这些结果表明，膜蛋白（XDC8的抗病毒作用是(XDC8与Gag MA区相互作用，在细 胞膜Gag组装时，改变了 Gag的正常出芽途径，使Gag被内吞回细胞内。
[0034] 实施例2、CCDC8可以引起HIV-1 Gag的多泛素化和降解
[0035] CCDC8与Gag、0BSL1和Cul7相互作用。查阅文献，表明CCDC8与一种遗传病3M 综合征有关。3M综合征为常染色体隐性遗传病，主要表现为患者身材矮小、但智力正常。使 用外显子测序表明，70%患者有E3连接酶Cul7的突变，25%有0BSL1的突变，5%有(XDC8 的突变。3M综合征以及体外的免疫共沉淀实验把CCDC8、0BSL1和Cul7连接在一起，提示 他们在一个细胞通路里。我们也发现，单独0BSL1或Cul7并无抗HIV-1的作用（图6A)。 我们的免疫共沉淀实验也表明，HIV-1 Gag与（XDC8有相互作用（图6B)，Cul7与（XDC8、 0BSL1也有相互作用（图6C)。具体做法如下，转染48小时后，将细胞用下列缓冲液裂解 (20mM Tris-HCl，pH7.5，100mM NaCl，10%甘油，0.2mM EDTA，l%Triton X-100和 1%CHAPS 3-[3-(胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐，蛋白酶抑制剂）。将细胞裂解液与抗Flag M2珠子4°C孵育过夜（货号A2220, Sigma-Aldrich)。将珠子用缓冲液（50mM Tris-HCl， pH7. 5, 15〇mM NaCl,l〇mM NaF,ImM EDTA,1%Triton-X100,1%CHAPS,0.2%sarkosyl, 10%甘油），洗5遍。最后，用3Flag多肽（货号F4799, Sigma-Alrich)将珠子洗脱，进行 SDS-PAGE电泳，蛋白印迹实验分析。
[0036] 由于CCDC8与0BSL1和E3泛素连接酶Cul7有关，所以我们检测HIV-1 Gag是否 被CCDC8、0BSL1和Cul7泛素化了。使用质粒vGag-RRE、Rev、带有HA标签的泛素HA-Ub 和HA-Ub-K0R的突变体（K48R和K63R)，转染HEK293T细胞。24小时后，将50nM蛋白 酶体抑制剂PS341加入培养基中。再过12小时，使用RIPA缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7. 4, 150mM NaCl, ImM EDTA, 1. 0%甘油，0? 5% SDS, 5mM去泛素化酶抑制剂N-乙基-马来 酰胺N-ethylmaleimide，蛋白酶抑制剂）裂解细胞，4°C离心10, 000g30分钟。将上清5 倍稀释，调节上述缓冲液中的浓度变为含有〇. 1% SDS和1. 0% NP-40。免疫共沉淀实验， 使用抗Gag的抗体（1:200稀释），4°C旋转混匀过夜。第二天，加入蛋白A珠子（CL4B，货 号17-0780-01，GE公司）4°C孵育4小时。离心，去上清。用缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7. 4, 150mM NaCl, ImM EDTA, 1. 0%甘油，1. 0% NP-40, 5mM N-乙基-马来酰胺），将珠子洗 两遍。最后，用pH 2. 0的0. 1M甘氨酸将珠子洗脱，进行SDS-PAGE电泳，做蛋白印迹实验， 分析结果。如图7所示，使用免疫共沉淀实验，我们发现在蛋白酶体抑制剂PS341存在下， Gag呈拖尾转态，即Gag被多泛素化了（图7B，7道）。而对比其他泳道，在没有Gag，或者没 有HA标记的泛素Ub，或者没有PS341情况下，都没有检测到Gag被多泛素化。
[0037] 为检测多泛素化的Gag是否导致降解，我们用同位素[35S]标记蛋白，免疫共沉淀 HIV-1 Gag，追踪不同时间点的Gag情况。将质粒vGag-RRE、Rev、CCDC8、空载体转染HEK293T 细胞。40小时后，用PBS洗细胞，将细胞用不含蛋氨酸和胱氨酸的DMEM培养基（含2%经透 析的胎牛血清，Invitrogen)培养30分钟。于是，将细胞在含有200 y Ci [35S]标记的蛋氨酸 和月光氨酸（Express[35S]Protein Labelling Mix, NEG07200, Perkin Elmer Life Sciences) 的培养基中孵育20分钟。加入37°C预温的含10%胎牛血清和5mM未标记的蛋氨酸和胱氨 酸的DMEM培养基，终止反应，以此作为起始点0分钟。以后，分别于15、30、60和120分钟， 取细胞，裂解细胞，加入抗Gag抗体（1:200)，进行免疫共沉淀实验。然后，进行SDS-PAGE 电泳，电泳后，将胶在含40%甲醇、10%冰醋酸和10%甘油的缓冲液中固定2小时。为放大 [ 35S]的信号，加入放大液NAMP100 (GE公司）放大15分钟，干胶。放上X光片，置于-80°C 冰箱，曝光2天-1周。取出后，洗片，使用ImageJ软件定量分析。我们发现，在表达CCDC8 时，Gag的半衰期大约20分钟，而没有(XDC8时，大约80分钟，也就是说(XDC8明显加快了 HIV-1 Gag 的降解（图 7C，7D)。
[0038] 总结上述结果，我们发现(XDC8可以和HIV-1 Gag MA区结合，（XDC8具有强烈的 抗HIV-1的活性，其抗病毒活性与膜蛋白（XDC8诱导HIV-1 Gag的内吞、多泛素化和降解有 关。我们发现了一个新的通路可以降解HIV-1 Gag，总结如图7E。
[0039] 下面我们将CCDC8截短，看是否还具有抗病毒活性。我们使用聚合酶链式反应 (PCR)技术，构建克隆。引物如表1所示，上游引物带有限制性内切酶BamHI位点，下游引物 带有 EcoRI 位点。使用引物 IT-CCDC8-BamHI 和 IT-CCDC8-EcoRI-514 扩增 pTT5-SH5-CCDC8 后得到PCR片段后，进行琼脂糖胶电泳，将产物切胶回收纯化。用BamHI和EcoRI酶切后， 连接入PTT5-SH5载体的BamHI和EcoRI位点，得到CCDC8的C末端截短体A 514-520。依 次类推，使用引物 TT-CCDC8-BamHI 分别与 IT-CCDC8-EcoRI-449, IT-CCDC8-EcoRI-340， IT-CCDC8-EcoRI-275,分别得到截短体 A 449-520, A 340-520 和 A 275-520。同样，使用引 物 TT-CCDC8-BamHI-280 和 TT-CCDC8-EcoRI， TT-CCDC8-BamHI-367 和 TT-CCDC8-EcoRI 构 建N末端截短体A 1-280和A 1-367。所有克隆经Invitrogen公司测序确认无误，其中 A 275-520为SEQ ID No. 3。SEQ ID No. 4蛋白序列是根据三联密码子规则由SEQ ID No. 3 翻译而来。我们发现，将C端截短后，直到275位，依然有抗病毒活性，但是N端截短后则失 去了活性，也就是N端前274个氨基酸具有非常重要的抗病毒活性（图8A，8B)。
[0040] 表1 :构建(XDC8截短体引物序列表
[0041]
【主权项】
1. 一种具有强烈抑制HIV-I活性的人体细胞编码的蛋白卷曲螺旋结构蛋白 8(Coiled_coil domain containing protein 8, CCDC8)，基因序列 SEQ ID No. 1。2. -种具有强烈抑制HIV-I活性的人体细胞编码的蛋白卷曲螺旋结构蛋白 8(Coiled_coil domain containing protein 8, CCDC8)的蛋白序列 SEQ ID No2〇3. -种具有抗HIV-I活性的卷曲螺旋结构蛋白8截短体的含有274个氨基酸的N末端 蛋白，基因序列SEQ ID No. 3。4. 一种具有抗HIV-I活性的卷曲螺旋结构蛋白8截短体的含有274个氨基酸的N末端 蛋白，蛋白序列SEQ ID No. 4。5. 权利要求2所述的卷曲螺旋结构蛋白8或权利要求4所述的卷曲螺旋结构蛋白8截 短体的N末端蛋白在制备治疗HIV-I药物中的应用。6. 权利要求1所述的卷曲螺旋结构蛋白8的应用，其特征在于所述的卷曲螺旋结构蛋 白8和OBSLl和E3泛素连接酶Cul7在引起HIV-IGag泛素化降解的新通路在抗HIV-I药 物研发方面的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用包括抗体、小分子化合物和多 肽药物的研发与构建。
【专利摘要】本发明涉及一种新的具有抑制人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的卷曲螺旋结构蛋白8及其应用。本发明提供的人体细胞产生的卷曲螺旋结构蛋白8(Coiled-coil？domain？containing？protein？8，CCDC8)具有极强的抗HIV-1的作用，通过和HIV-1Gag的基质蛋白区结合，阻止Gag蛋白在细胞膜上的组装。卷曲螺旋结构蛋白8和OBSL1、E3泛素连接酶Cul7一起引起HIV-1Gag的内化、多泛素化和降解。本发明基于卷曲螺旋结构蛋白8构建了一个新的质粒可以表达新的蛋白，即卷曲螺旋结构蛋白8的N末端274个氨基酸组成的蛋白，可以降解HIV-1。
【IPC分类】A61P31/18, C07K14/47, A61K38/17, C12N15/12
【公开号】CN105039348
【申请号】CN201510090585
【发明人】魏民, 邵一鸣, 劳闰斯·克雷曼
【申请人】南开大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年2月28日