照1%接种量 接种至新鲜LB培养基中培养24小时，去10mL菌液按照上海生工细菌基因组提取试剂盒所 提供的方法提取该菌基因组总DNA。
[0033] 实施例2 :麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因的构 建
[0034] 根据NCBI上登录的Arthrobacter sp.基因组序列分别设计引物F1和R1 (扩增 麦芽寡糖基海藻糖合成酶）、F2和R2 (扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶），引物序列如下：
[0035] F1:GAATTCGTGTTGACACCGAAATCGACCTACC
[0036] R1CCTCGGGGGTGAACGTGC
[0037] F2:ATGAGTTCGCCATTCGAGGT
[0038] R2:GCGGCCGCGTCGAGCAGGTGGATGGAGG
[0039] 以实施例1制得的总DNA为模板，F1和R1为引物，利用TaKaRa Ex Taq?说明书 提供的体系进行PCR;
[0040] PCR 条件为：95°C变性 5min ;95°C变性 30sec，54°C退火 30sec，72°C延伸 2. 5min， 共30个循环；72°C延伸10min，4°C保存；
[0041] 割胶回收1700bp左右条带，作为产物1备用；
[0042] 以实施例1制得的总DNA为模板，F2和R2为引物，利用TaKaRa Ex Taq?说明书 提供的体系进行PCR;
[0043] PCR 条件为：95°C变性 5min ;95°C变性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 2min，共 30个循环；72°C延伸10min，4°C保存；
[0044] 割胶回收2300bp左右条带，作为产物2备用；
[0045] 随后将获得的产物1和产物2通过重叠PCR方法实现两基因间的拼接；
[0046] PCR条件为：产物1和产物2与酶液混合后，95°C变性5min ;95°C变性30sec，56°C 退火30sec，72°C延伸2. 5min，5个循环；然后补加引物F1和R2 ;95°C变性30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 4. 5min，共 30 个循环；72°C延伸 10min，4°C保存；
[0047] 采用1 %琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析（图1)，结果表明在泳道1和2中 4000bp左右位置有特异性目的条带出现，与理论值4059bp接近，表明融合酶的目的基因序 列已被成功构建。
[0048] 割胶回收约4000bp左右麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融 合酶目的基因序列，并与PMD18-T载体连接获得pMD18-MM，转化大肠杆菌JM109后筛选阳性 重组子测序并保存；经检测，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，表达的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
[0049] 实施例3 :融合酶基因在毕赤酵母中的表达
[0050] 所述毕赤酵母表达所用载体为可以实现毕赤酵母胞内（以pPIC3. 5K为例）或胞 外（以PPIC9K为例）表达的载体。
[0051] 提取PMD18-MM质粒使用EcoRI和Notl双酶切，后与经相同两种酶酶切后的 pPIC3. 5K和pPIC9K相连接，获得异源表达载体pPIC3. 5K-MM和pPIC9K-MM，将所获载体经 Bglll线性化后，通过电转化的方法（2500V，5ms)转化毕赤酵母GS115中，并采用G418筛选 阳性重组子。
[0052] 实施例4 :重组融合酶的表达、纯化及性质测定
[0053] 按照毕赤酵母GS115表达手册对所获得的毕赤酵母重组子进行异源表达。
[0054] 该工程菌用1. Owt%甲醇诱导72h后，离心收集发酵上清液（对胞内表达重组毕赤 酵母需先进行细胞破碎），分别采用盐析、透析、离子交换和凝胶过滤进行纯化，对重组融合 酶的酶学性质进行测定。
[0055] 结果表明所获融合酶能够同时展示出麦芽寡糖基海藻糖合成酶（比酶活： 147. 4U/mg)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（比酶活：160. lU/mg)两种酶的活性，海藻糖合成 酶和海藻糖水解酶酶活比约为1:1.1，该比例与理论最佳的反应比例（1:1)相近，且融合 酶的酶学性质与融合之前的两种酶相似（最适pH值均在5. 5左右，最适温度均为50°C )， 以500U/L的添加量在50°C下转化20wt%的淀粉乳液20小时所得的海藻糖转化率可达 85. 3%，麦芽三糖含量为1. 2%，到达相同转化率时间较现有双酶法相比节约了近4小时。
【主权项】
1. 麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的表达基因，核苷酸序 列如SEQ ID NO: 1所示。2. 麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。3. -种重组载体，在质粒中插入权利要求1所述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列。4. 如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述质粒为pPIC3. 5K载体质粒或 PPIC9K载体质粒。5. -种转基因细胞系，宿主细胞内转化有上述重组载体。6. 如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。7. 权利要求1所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的表达 基因、权利要求3所述重组载体或权利要求5所述转基因细胞系在制备麦芽寡糖基海藻糖 合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶中的应用。8. 权利要求1所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的表达 基因在制备海藻糖与麦芽三糖中的应用。
【专利摘要】本发明涉及海藻糖合成酶-海藻糖水解酶融合酶及其表达基因与应用。麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示，其表达基因核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1所示。本发明采用基因工程技术构建了一种新颖的麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶，所述融合酶同时具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶两种酶的活性，与传统双酶法相比有效的简化了生产工艺。
【IPC分类】C12P19/12, C12P19/00, C12P19/24, C12N9/24, C12N15/81, C12N9/90, C12N1/19, C12N15/62
【公开号】CN105039371
【申请号】CN201510431597
【发明人】王腾飞, 汪俊卿, 王瑞明
【申请人】齐鲁工业大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月21日