物（Reverse primer) 5' - Biotin-CTCCTTTTCCATCTCCATA -3' （SEQ ID N0.5)， (3) 甲基化特异性测序引物（Sequencing primer) 5' - TTTTCCATCTCCATAA -3' （SEQ ID N0.6) 具体实验步骤： A?采用EZ DNA甲基化试剂盒-Gold (EZ DNA Methylation-Gold? Kit; ZYMO RESEARCH)对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化； B. 取步骤A中转化过的DNA样本30ng加入到Zymo Taq? PreMix酶（Zymo Taq? PreMix，ZYMO RESEARCH)，并分别加入上述两对谷氨酸脱氢酶基因和蛋白酪氨酸磷酸酶N1 基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95°C 10min的变性； 接着95°C 30s，Tm45s，72°C 60s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72°C 10min。 (注：Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定）； C. 焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45 y 1含有0. 3 y M上述甲基化特 异性测序引物的退火缓冲液（PyroMark Annealing Buffer; Qiagen);将需要使用的混勾 的琼脂糖珠总量(每样本3 y 1)转移到一个Eppendorf管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液 (PyroMark Binding Buffer; Qiagen)，使得平均每个样品约有50 yl的体积，将混合物混 匀；将以上混合物加入PCR产物（50 yl反应体积）中，每样本50 yl ;将PCR产物在常温下 混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml 的高纯水、70%乙醇、洗涤缓冲液（PyroMark Wash Buffer; Qiagen;)和120ml的变性缓冲 液（PyroMark Denaturation Solution; Qiagen);打开真空预备工作站的栗，将真空准备工 具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具（PyroMark Vacuum Prep Filter Probes; Qiagen)移到PCR板中，抓取琼脂糖珠(在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作）;拿 起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70% 乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5 - 10秒；关掉栗；将 真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠(测序引物也可最后加入）；使 用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80°C 2分钟，再 冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应； D.焦磷酸测序：在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒 (Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen)对步骤C中的PSQ96板中的样本进行测序，然后 应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析。甲基化水平检测结果示例见图2/77W7基 因被检测序列所在区域及所检测的8个CpG点的相关性示意图（灰色阴影中显示的是对应 CpG位点的信号强度，结合该位点附近碱基种类可分析得到其甲基化水平-即灰色阴影对 应的上方数字），如图2所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，图中所示CpGl到CpG8 的甲基化程度分别为4%，3%，4%，10%，5%，4%，5%，5%。
[0015] 4、数据分析 本次研究采用SPSS 18. 0对数据进行整理分析，我们发现：被检测/77W7基因启动子8 个CpG位点间存在相关联(相关系数r > 0. 153，p〈0. 001，有统计学意义，见图1)，所以我 们把CpGl-CpG8求平均值后参与到后续的分析中，发现病例组和对照组之间的DNA甲基化 水平存在显著差异及临床生化指标甘油三酯（TG)和肌酐（CRE)也存在显著的统计学差异 (p〈0. 001，见表1)。因此，我们分性别比较了病例组和对照组间/77W7基因启动子区甲基 化水平的差异，结果(见表2)发现CpGl-8在女性中均与2型糖尿病存在关联（p〈0. 05)，而 在男性中却与T2DM无相关性，并且由表2可知，病例组的/77W7基因甲基化水平大于对照 组，因此，尸77W/基因启动子区甲基化水平与2型糖尿病患病率呈正相关。
[0016] 表1 /77W7基因病例组与对照组间的比较（n=194)
表2 /77W7基因分层后病例组与对照组间的比较
注：n表示样本个数；加a表示进行过对数转换；加粗的为/?{直小于0. 05,具有统计学 意乂；。
[0017] 本发明可用于检测2型糖尿病相关的蛋白酪氨酸磷酸酶N1基因启动子区甲基化 程度的试剂盒具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。本发明采用上述试剂盒对尸77^/ 基因启动子区甲基化水平进行检测，能够快速可靠地为2型糖尿病的辅助诊断、检测或筛 查药物治疗提供借鉴。
[0018] 上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通 技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护 范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
【主权项】
1. 一种可用于检测与2型糖尿病相关的/7KV7基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其 特征在于：该试剂盒包括/TKW基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物及其甲基化特 异性扩增下游引物和甲基化特异性测序引物，其中 所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示： 5' _ TAGGGGTAGGGGATTGTA -3' 所述的甲基化特异性下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示： 5' - Biotin-CTCCTTTTCCATCTCCATA -3'， 所述的甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO. 3所示： 5' - TTTTCCATCTCCATAA -3'。2. -种如权利要求1所述的可用于检测与2型糖尿病相关的/7KV7基因启动子区甲基 化程度的试剂盒的应用，其特征在于：该试剂盒可用于2型糖尿病辅助检测、诊断或药物治 疗中。3. 根据权利要求2所述的可用于检测与2型糖尿病相关的/7KV7基因启动子区甲基化 程度的试剂盒的应用，其特征在于：该试剂盒可用于女性人群2型糖尿病辅助检测、诊断或 药物治疗中。
【专利摘要】本发明公开了可用于检测与2型糖尿病相关的<i>PTPN1</i>基因甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对<i>PTPN1</i>基因甲基化特异性扩增引物及甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ？ID？NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQ？ID？NO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对女性人群2型糖尿病的检测，检测效率高，针对性强，同时，以<i>PTPN1</i>基因甲基化为靶点的药物有望成为2型糖尿病辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105039543
【申请号】CN201510428933
【发明人】韩丽媛, 段世伟, 麦一峰, 黄清, 周恩呈, 刘艳芬, 陆南佳
【申请人】宁波大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月21日