Plus发光激酶检测试剂盒。它通过测量激酶反应后 溶剂中ATP的量来评定激酶活性。发光信号强弱与ATP的量成正比而与激酶活性成反比。 将测试化合物在10% DMSO中稀释至100 μ M，然后取出5 μ 1的稀释液加入到50 μ 1的反应 中以保证所有反应中DMSO的最终浓度均为1 %。所有的酶促反应均在30°C下反应40min。 在50 μ 1的反应混合物中包含40mM的三羟甲基氨基甲烷（Tris)，IOmM的MgCl2,0. lmg/mL 的牛血清白蛋白（BSA)，0· 2mg/mL的复合基质（Glu，Tyr)，10 μ M的ATP和EGFR，并控制pH 保持在7. 4。在酶促反应结束后，向每个反应中加入50 μ 1的Kinase-Glo Plus发光激酶检 测溶剂并随后在室温下培育5min。发光信号通过Tecan公司的无限M1000型酶标仪来测 定。
[0074] IC5。值的测定通过使用ADP-GloTM检测试剂盒来完成。它通过蛋白激酶来测定ADP 的生成，在上述试剂盒中伴随激酶反应而生成的ADP会导致发光信号增强。首先，将反应混 合物置于96孔板中于30°C下培育30min，随后向其中加入25 μ 1的ADP-GloTM试剂。摇晃 该96孔板，然后于室温下继续培育40min。最后加入50 μ 1的激酶检测试剂，随后96孔板 的结果通过GloMax酶标仪来读取。空白组的试验方法与样品组完全平行一致。最终，蛋白 激酶的活性数值通过减除空白组的数值来进行校正。
[0075] 按照上述方法，测试本发明代表性化合物与EGFR的结合，IC5。值的结果示于表1。
[0076] 表 1
[0078] 实施例20 :Α-549细胞增殖测定
[0079] 按照 Stockert 等（Acta Histochemica, 2012, 114 (8)，785-796)介绍的方法，进行 本项测定。
[0080] 本测定使用MTT法并利用人类肺癌细胞株Α549来评价发明代表性化合物的抗肿 瘤增值活性。Α549细胞株在Dulbecco氏改进的Eagle培养基（DMEM)上进行培养，该培 养基包含10%小牛血清（FBS)，lOOU/mL的青霉素以及100g/mL的链霉素。当细胞增殖至 80~90%时使其合并随后进行不超过20代的传代培养，然后在下一步处置前使它们适应 环境达到24h。将这些细胞置于96孔板上（8X IOVmL)，然后在含有5% CO2的湿润环境中 培养过夜并控温在37°C。24h过后加入20 μ Μ/50 μ M的发明代表性化合物。再经过24h的 培养，向其中加入MTT (5mg/mL)并继续培养4h。移除培养基质，将晶体溶解于DMSO中，利 用酶标仪（TECAN SPECTRA，Wetzlar，德国）在490nm波长下测量吸光度。抑制作用通过抑 制率和IC5。值来表示。
[0081] 按照上述方法测定本发明代表性化合物，结果示于表2。
[0082] 表 2
[0083]
[0084] 实施例21 :对卵巢癌细胞SK0V3增殖的作用
[0085] 对数生长期细胞用胰酶消化后，以6X IO3个/孔细胞数加人96孔培养板，置37°C、 5% CO2培养箱中培养，第2天待大部分细胞贴壁后置人4°C恒温箱lh，以促成细胞同步化 生长。吸去上清液，加人含10%新生小牛血清（FCS)RPMI 1640培养液，200 μ L/孔，按实验 设计分组。把无菌生理盐水配制的化合物注射液加入96孔中，每孔中加入200 μ L，使每孔 的药物浓度分别为lmg/mL、2mg/mL和5mg/ml，以Omg/mL为阴性对照组。继续培养24、48、 72h后，各孔分别加人20 μ L MTT溶液（浓度为5mg/mL)，轻轻震荡培养板，放回培养箱内再 孵育4h，然后吸尽上清液，于各孔中加二甲亚砜200 μ L，置震荡器上震荡5-10min，用酶标 光度计测出每孔中波长为580nm的吸光值（A = 580)，A = 580值与活细胞数量成正比。
[0086] 按照上述方法测定本发明代表性化合物，结果示于表3。
[0087] 表 3
[0089] 实施例22 :对骨肉瘤细胞U20S-EGFP-4A12G增殖的作用
[0090] 对数生长期细胞用胰酶消化后，台盼蓝计数，配制成细胞密度为IX IO4个/mL的 细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200 μ L，每孔约2 X IO3个细胞，预培养24h，把无菌生理 盐水配制的化合物注射液加入96孔中，每孔中加入200 μ L，使每孔的药物浓度分别为Img/ mL、2mg/mL和5mg/ml，以Omg/mL为阴性对照组。在分别培养Oh、12h、24h和48h后每孔加 入MTT溶液（5mg/mL) 20 μ L，继续孵育4h，终止培养。小心吸弃培养孔中的上清液，每孔加 入150 μ L的二甲基亚砜（DMSO)，震荡lOmin，使甲腊充分溶解，选择490nm波长，在酶联免 疫检测仪上测定各孔光吸收值（A值），重复检测5次。
[0091] 按照上述方法测定本发明代表性化合物，结果示于表4。
[0092] 表 4
[0093]
[0094] 制剂实施例
[0095] 下列制剂实施例仅举例说明本发明的保护范围，但不以任何方式构成限定。
[0096] 实施例23:明胶胶囊
[0097] 硬明胶胶囊的制备采用：
[0099] 可以根据所提供的合理变化来改进上述制剂。
[0100] 实施例77 :片剂 [0101] 片剂的制备采用
[0103] 将上述组分混合并压制成片剂。
[0104] 实施例24 :片剂
[0105] 每片中含有2. 5-1000mg活性组分的片剂制备如下：
[0106]
[0107] 使活性成分、淀粉和纤维素通过45号目筛并彻底混合。将聚乙烯吡咯烷酮溶液与 所得粉末混合，随后经14号目筛。将生成的颗粒在50-60°C下干燥并经18号目筛。将预先 经过60号目筛的羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁和滑石粉加入到上述颗粒中，随后混合，在压 片机上压制得到片剂。
[0108] 实施例25 :混悬液
[0109] 每5ml含有0· I-1000 mg药物的混悬液制备如下：
[0111] 令药物经45号目筛并与羧甲基纤维素钠和糖浆混合形成平滑的糊剂。将苯甲酸 溶液、矫味剂和着色剂用一些水稀释并在搅拌下加入上述糊剂。随后加入足量的水以达到 所需的体积。
[0112] 实施例26:组合片剂
[0115] 使活性成分、淀粉和纤维素通过45号目筛并彻底混合。将聚乙烯吡咯烷酮溶液与 所得粉末混合，随后经14号目筛。将生成的颗粒在50-60°C下干燥并经18号目筛。将预先 经过60号目筛的羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁和滑石粉加入到上述颗粒中，随后混合，在压 片机上压制得到片剂。
[0116] 对于上述说明，本领域技术人员可容易地理解本发明的必要特征，不背离本发明 的精神和范围，本发明可进行各种改变和改进以适应不同的应用和条件。
【主权项】
1. 一种式I的化合物： 其中R1、R2分别独立地选自氢、C「C4烷基、卤素取代或未取代的苯基、或R i、R2与它们相连的 氮原子一起组成吡咯烷基，哌啶基，吗啉基。2. 如权利要求1所述的化合物，其前体药物和药物活性代谢物，以及上述化合物药学 上可接受的盐，其中： R1、R2分别独立地选自氢、乙基、苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基，或R i、R2与它们 相连的氮原子一起组成吡咯烷基，哌啶基，吗啉基。3. 如权利要求1或2所述的式I的化合物，其前体药物和药物活性代谢物，以及上述化 合物药学上可接受的盐，选自： 4-[2-(4-吗啉基）甲酰基甲氧基苯硫基]-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d] 嘧啶； 4-[2-(1-哌啶基）甲酰基甲氧基苯硫基]-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d] 嘧啶； 4-(2-二乙胺基甲酰基甲氧基苯硫基）-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d]嘧 啶； 4-[2-(1_吡咯烷基）甲酰基甲氧基苯硫基]-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d] 嘧啶； 4-(2-苯胺基甲酰基甲氧基苯硫基）-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d]嘧啶； 4_ [2-(4-氟苯胺基）甲酰基甲氧基苯硫基]-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d] 嘧啶； 4-[3-(4-吗啉基）甲酰基甲氧基苯硫基]-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d] 嘧啶； 4-[3-(1_吡咯烷基）甲酰基甲氧基苯硫基]-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d] 嘧啶； 4-(3-苯胺基甲酰基甲氧基苯硫基）-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d]嘧啶； 4_ [3-(4-氟苯胺基）甲酰基甲氧基苯硫基]-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d] 嘧啶； 4-[4-(4-吗啉基）甲酰基甲氧基苯硫基]-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d] 嘧啶； 4-[4-(1-哌啶基）甲酰基甲氧基苯硫基]-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d] 嘧啶； 4-(4-二乙胺基甲酰基甲氧基苯硫基）-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d]嘧 啶； 4-[4-(1_吡咯烷基）甲酰基甲氧基苯硫基]-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d] 嘧啶； 4-(4-苯胺基甲酰基甲氧基苯硫基）-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d]嘧啶； 4_ [4-(4-氟苯胺基）甲酰基甲氧基苯硫基]-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d] 嘧啶； 4_ [4-(4-氯苯胺基）甲酰基甲氧基苯硫基]-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d] 嘧啶； 4_ [4-(4-溴苯胺基）甲酰基甲氧基苯硫基]-5, 6, 7, 8-四氢苯并[4, 5]噻吩并[2, 3-d] 嘧啶。4. 一种药物组合物，包含权利要求1-3任何一项所述的式I的化合物，其前体药物和 药物活性代谢物，以及上述化合物在药学上可接受的盐作为活性成分和药物可接受的载 体。5. 权利要求1-3任何一项所述的式I化合物或权利要求4所述的药物组合物在制备抗 肿瘤药物中的应用。6. 权利要求1-3任何一项所述的式I化合物或权利要求4所述的药物组合物在制备治 疗非小细胞肺癌药物中的应用。7. 权利要求1-3任何一项所述的式I化合物或权利要求4所述的药物组合物在制备预 防和治疗与表皮生长因子受体信号转导失调相关的疾病药物中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述表皮生长因子受体为HER-I、HER-2、 HER-3 或 HER-4。9. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的细胞为除血管组织和造血系统外 的上皮细胞、腺上皮及胚胎细胞，除肾小球及周围神经外的所有成年组织细胞。10. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：其中所述的表皮生长因子受体信号转导 失调的相关疾病为鳞癌，腺癌，大细胞癌，结肠直肠癌、乳腺癌，卵巢癌，肾细胞癌或支气管 哮喘。
【专利摘要】本发明属于医药技术领域，涉及含有酰胺的四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3<i>-d</i>]嘧啶类化合物及其作为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂应用，及其制备方法。含有酰胺的四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3<i>-d</i>]嘧啶类化合物和药学上可接受的盐，及其药学上配伍可接受的载体或稀释剂作为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂。其结构通式如下所示：R1、R2分别独立地选自氢、C1-C4烷基、卤素取代或未取代的苯基、或R1、R2与它们相连的氮原子一起组成吡咯烷基，哌啶基，吗啉基。本发明的这类化合物的合成方法简便，适于工业化生产，生物活性测试显示此类化合物具有抑制表皮生长因子作用,是一种具有抗肿瘤作用的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/519, A61K31/5377, A61P11/06, C07D495/04
【公开号】CN105061462
【申请号】CN201510516034
【发明人】胡春, 孙冰, 徐越, 张富荣, 黄钰淑, 金辄, 刘晓平, 黄二芳, 王金辉
【申请人】沈阳药科大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月18日