一种新的贝壳杉烷类二萜化合物及其制备方法和医药用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物领域，具体涉及从珊瑚树的干燥叶中分离得到的一种新的贝壳杉 烷类二萜化合物及其制备方法和医药用途。
【背景技术】
[0002] 珊瑚树是忍冬科（Caprifoliaceae)荚莲属植物（Viburnumod oratissimum)，常 绿灌木或小乔木，别名：高栌树、早禾树、珊瑚枝、法国冬青。原产我国，主要分布于湖南、福 建、广东、台湾及浙江，日本、朝鲜也有分布。珊瑚树的原变种是Viburnum odoratissimum Ker-Gawl. var. odoratissimum，其他两个变种分别为日本珊瑚树（Viburnum odoratissimum Ker-Gawl. var. awabuki)和云南珊瑚树（Viburnum odoratissimum Ker-Gawl. var. sessiliflorum);始载于《中国高等植物图鉴》，它的枝叶可入药，有通经活 络功效，主治风湿痹痛、跌打肿痛、骨折。
[0003] 珊瑚树中主要含有二萜、三萜、黄酮、倍半萜、木脂素及香豆素苷等类化合物。其中 vibsanin型二萜类化合物是珊瑚树的特征化合物，根据现代研究报道它只存在于荚莲属的 V. awabuki、V. odoratissimum和V. suspensum中，其分为3种亚型结构即十一元环型、七元 环型和重排型，这3种亚型化合物在强光或高温下会发生重排反应。
[0004] 珊瑚树主要具有细胞毒、抑菌、鱼毒、抑制植物生长等活性，其中细胞毒活性是其 主要生物活性，近年来研究发现珊瑚树中成分对KB、A-549、HT-29、P-388、NUGC-3和H0NE-1 等细胞表现出细胞毒活性。另外，从珊瑚树中分离出来的有机酸和黄酮成分有较强的抑菌 效果。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种从珊瑚树的干燥叶中分离得到的一种新的贝壳杉烷 类二萜化合物；
[0006] 本发明的另一目的在于提供该新化合物的制备方法；
[0007] 本发明的再一目的在于提供该化合物用于制备治疗黑色素瘤药物的医药用途。
[0008] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0009] 具有下述结构式的化合物（I )，
[0010]
[0011] 所述的化合物（I )的制备方法，包含以下操作步骤：(a)珊瑚树的干燥根茎粉 碎，用80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和 的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤（a)中 乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，依次用8%乙醇和75%乙醇洗脱，收集75%乙醇洗脱液， 减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤（b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依 次用体积比为80:1、45:1、20:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d) 步骤（c)中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1、20:1和15:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤（d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶 分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-12个柱体积洗脱液，洗脱液 减压浓缩得到纯的化合物（I )。
[0012] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0013] 药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（I )和药学上可接受的载体。
[0014] 所述的化合物（I )在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
[0015] 所述的药物组合物在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。
[0016] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0017] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I )，其余为药物学上可接受的、 对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0018] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
[0019] 说明书附图
[0020] 图1为化合物（I )结构式；
[0021] 图2为化合物（I )理论E⑶值与实验E⑶值比较；
[0022] 图3为BrdU免疫荧光检测细胞增殖结果。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0024] 实施例1 :化合物（I )分离制备及结构确证
[0025] 药材和试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海 凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。珊瑚树药材购自 安徽亳州中药材市场，产地福建。
[0026] 制备方法：（a)将珊瑚树的干燥叶（8kg)粉碎，用80%乙醇热回流提取（25LX3 次），合并提取液，浓缩至无醇味（6L)，依次用石油醚（6LX3次）、乙酸乙酯（6LX3次）和 水饱和的正丁醇（6LX3次）萃取，浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（315g) 和正丁醇萃取物；(b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用纯净水溶解至2L，医用脱脂棉过滤，滤 液用AB-8型大孔树脂（I. 5kg)分离，依次用8%乙醇（IOL)和75% (12L)乙醇洗脱，收集 75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱物浸膏（155g) ; (c)步骤（b)中75 %乙醇洗脱 浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为80:1 (10个柱体积）、45:1 (8个柱体积）、 20:1 (8个柱体积）、10:1 (8个柱体积）和1:1 (5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得 到5个组分；（d)步骤（c)中组分3 (36g)用200-300目正相硅胶进一步分离，依次用体积 比为25:1 (8个柱体积）、20:1 (8个柱体积）和15:1 (5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中组分2(12g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶0DS-C18 分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-12个柱体积洗脱液，洗脱液 减压浓缩得到纯的化合物（I ) (25mg)。
[0027] 结构确证：HR-ES頂S显示[M+Na]+为m/z 401. 1614,结合核磁特征可得分子式为 C20H26O7，不饱和度为 8。核磁共振氢谱数据 δ H (ppm，DMS0-d6, 500MHz) :H-1 (5.98, dd，J = 11. 9, 5. 8)，H-2 (2. 36, m)，H-2 (2. 29, overlap)，H-3 (3. 90, m)，H-5 (2. 84, br，s)，H-6 (5. 95， br，s)，H-9 (2.89, d，J = 3.6)，H-Il (5.07, m)，H-12 (2. 27, overlap)，H-12 (1.99, m)， H-13 (2. 64, m)，H-14 (3. 69, d，J = 10. 8)，H-14 (3. 05, dd，J = 10. 8,4. 0)，H-17 (I. 43， s)，H-18 (I. 27, s)，H-19 (I. 22, s)，H-20 (4. 55, d，J = 8. 8)，H-20 (4. 57, d，J = 8. 8)， 3-OH(4.77, s)，16-OH(4.62, s);核磁共振碳谱数据 Sc(ppm，DMS0-d6，125Hz) :76.7(CH， 1-C)，31· 9(CH2,2-C)，72· 4(CH，3-C)，37· 3(C，4-C)，54· 9(CH，5-C)，101. 5(CH，6-C)， 171. 4(C，7-C)，56. 4(C，8-C)，49. 8(CH，9-C)，48. 9(C，10-C)，64. 7(CH，n-C)，33. 5(CH2， 12-C)，40. 5(CH，13-C)，32. 6(CH2,14-C)，211. 8(C，15-C)，77. 7(C，16-C)，19. 9(CH3,17-C)， 29.1(CH3，18-C)，15.8(CH3，19-C)，73.4(CH2,20-C);碳原子标记参见图 1。13C NMR 和 DEPT 谱显示该化合物含有三个甲基，四个亚甲基（一个含氧），七个次甲基（四个含氧），六 个季碳（一个含氧碳，一个酮羰基碳以及一个内酯羰基碳）。HMBC谱中H 2-H ( δ H3. 69 和 3. 05)、Η-13 ( δ Η2· 64)、Η2-12 ( δ Η2· 27 和 1. 99)和 Me-17 ( δ HL 43)与含氧季碳 C-16(SC77. 7)的相关性表明C-16位上连有一个羟基基团。HMBC谱中Η2-2(δΗ2. 36和 2. 29)，Μθ-18(δΗ1.27)和 Μθ-19(δΗ1.22)与氧化次甲基 C-3(SC72. 4)的相关性，以及 1H-1H COSY谱中H-2和H-3的相关性，表明C-3位上存在一个羟基基团。ROESY谱中H-I与 Η-3、Η-5 β和Me-18,以及Me-17与Η-12 α的相关性表明C-3-OH和C-16-OH分别为α和 β构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确 定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致（图 2) 〇
[0028] 实施例2 :化合物（I )药理作用试验
[0029] 一、材料和仪器
[0030] 人A375黑色素瘤细胞株由第三军医大学赠。化合物（I )自制，制备方法见 实施例1，HPLC归一化纯度大于98 %。DMEM培养基、0.25 %胰酶购自美国Gibco公司。 MTT (3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐；四甲基偶氮唑蓝）、DMS0 (二甲基亚 砜）、BrdU购自美国Sigma公司。鼠抗BrdU多克隆抗体购自美国ABcam公司。山羊抗鼠 二抗购自美国Cell signaling公司。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国 Promega 公司。
[0031] 恒温CO2培养箱，普通冰箱，-80度冰箱均为美国Forma公司产品。超净工作台 (中国苏州净化工程公司）。倒置显微镜，倒置荧光显微镜（Olympus公司）。电热恒温培 养箱（中国上海跃进医疗器械厂）。自动酶标仪（日本Wako公司）。紫外分光光度仪（美 国Beckman公司）。J6-HC高速离心机（美国Beckman公司）。低温微量离心机（德国 Eppendorf公司）。振荡摇床（美国Forma公司）。
[0032] 二、试验方法
[0033] 1、细胞培养
[0034] I. 1细胞复苏
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