3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸的两亲性衍生物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及一种3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸 的两亲性衍生物及其用途。
【背景技术】
[0002] 基因治疗（gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因 缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。在过去的二十多年间，基因治疗在很多疾病治疗 领域将研究从临床前推向了临床，对于由基因异常引起的，医药界至今难以解决的疾病如 肿瘤等具有无可替代的优势。常见的基因药物有质粒DNA (plasmid DNA，pDNA)、反义寡核苷 酸（antisense 0DN)、小干扰RNA(siRNA)和小发卡RNA(shRNA)。具有RNAi干扰效应，能特 异性沉默目的基因的siRNA是目前基因治疗研究的重点。
[0003] siRNA (Small interfering RNA)，又称为小干扰RNA，是长度20到25个核苷酸的 双链RNA。通过与之序列互补的mRNA相结合，促使mRNA降解，介导转录水平的基因表达抑 制，从而诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。siRNA的调控机制是通过互补配对来对相应 靶位基因的表达进行沉默，因此具有高度的特异性。所以将其作为治疗药物，具有广阔的发 展前景，对于恶性肿瘤、HIV等一系列病症的治疗具有重大意义。
[0004] 基因治疗的关键是将基因药物体内输送到靶细胞，使其发挥作用。然而，将外源基 因引入体内，其会被体内的核酸酶降解，在未进入靶细胞之前，便被降解成小分子核苷酸， 从而失去治疗作用。因此，实现基因治疗的关键是高效、安全的基因递送系统。
[0005] 基因载体在运送基因的时候要经历多个复杂的过程：通过血液循环到达靶细胞， 细胞摄取，内涵体的逃逸，胞内运动，载体释放基因物质。其主要障碍主要是复杂血液环境 的细胞外障碍和溶酶体酶降解的细胞内障碍。因此寻找良好的基因载体，使得靶基因到达 靶点发挥效用，是基因载体研究者亟待解决的问题。
[0006]目前，在基因输送载体系统方面主要分为两大类：一是病毒载体系统；二是非病 毒载体系统。病毒载体是一种天然的载体资源，病毒基因组结构简单，转染效率高，靶细胞 特异性强，但其导向性差、携带能力低、免疫原性和潜在致瘤性的局限性，使其难以达到临 床应用的要求。因此多样性、无免疫原性及易于控制生产的非病毒载体系统近年来备受关 注，并在很多治疗领域有所应用。常用的非病毒载体系统主要是脂质（cationic lipids)载 体。
[0007] 阳离子脂质的正电荷通过静电作用与带负电的基因药物结合，从而将基因物质浓 缩包装成较小粒径的粒子。复合物较小的粒径降低了被体内巨嗜细胞识别、吞噬、清除的机 会，提高了药物的体内生物利用度。同时，针对于肿瘤组织，复合物较小粒径更容易利用渗 透和滞留效应从血管内皮细胞间隙透过进入肿瘤实质，增加在肿瘤组织的药物聚集。在转 染方面，由于细胞表面略微带有负电，带正电的脂质体更容易吸附到细胞表面，通过内吞等 机制进入细胞，大大增加了脂质体的转染能力。
[0008] 目前阳离子脂质作为基因载体因其结构简单、操作简便、生物安全性高等特点成 为了目前应用最为广泛的非病毒载体，但大部分制备过程复杂，不易进行放大生产。因此本 发明尝试利用3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸，以其为结构基础，将其两亲性衍生物作 为基因药物的载体系统。此类衍生物合成步骤简单，原材料简单易得，同时，能较好递送基 因药物，成功解决了上述问题，达到了较好的基因治疗效果。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种3-(1-叔丁氧羰酰哌 嗪-4-yl)丙酸（即：3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-基）丙酸）的两亲性衍生物及其用途；该两 亲性衍生物是以3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸结构为基础的两亲性衍生化合物。本 发明的两亲性衍生化合物制备而成的胶束及脂质体，与基因药物siRNA复合后，能形成粒 径较小，分布均匀的复合物纳米粒子。复合物在PH7. 4环境下不带电或带负电，降低了与体 内血液环境中带负电蛋白吸附的机会，增加了脂质复合物的体内稳定性，减小因过多正电 荷引起的细胞毒性。本发明提供的脂质体，可将荧光素酶siRNA体外高效递送到人非小细 胞肺癌H1299-Pgl3细胞，特异性抑制基因表达。同时载体系统可以体内特异性转载荧光基 因药物进入正常小鼠肝脏细胞。
[0010] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0011] 第一方面，本发明涉及一种3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸的两亲性衍生物， 其结构式如式（I )所示：
R2为长碳链烷基或烷烃基。也可以表示为：Rl为碳链或亚油酸链，R2为碳链或亚油酸链。 其结构如具有以下特点：哌嗪基_(CH2)n_酯键-RlandR2
[0013] 优选地，Rl为含12~18个碳原子的长碳链烷基或烷烃基，R2为含12~18个碳 原子的长碳链烷基或烷烃基。如：
[0014]
[0015] 更优选地，所述Rl为第九个碳原子位置上为双键或第九、十二个碳原子位置上为 双键的长碳链烷烃基。如：
[0016]
[0017] 更优选地，所述R2为第九个碳原子位置上为双键或第九、十二个碳原子位置上为 双键的长碳链烷烃基。如：
[0018]
[0019] 优选地，所述R1、R2为相同的基团。
[0020] 优选地,其结构式如式（II )所示：
[0021]
[0022] 第二方面，本发明涉及一种制备上述的两亲性衍生物的方法，所述方法包括如下 步骤：
[0023] A、在四氢呋喃催化剂、红铝溶液的甲苯溶液的存在的条件下，含碳原子12-18的 直链脂肪酸在室温下发生还原反应得到含碳原子12-18的直链脂肪醇；
[0024] B、在三乙胺、4-二甲氨基吡陡、甲烷磺酸酐催化剂的作用下，含碳原子12-18的直 链脂肪醇在〇°C下发生磺酸酯化反应得到中间产物3 ;
[0025] C、在二甲基甲酰胺、溴化锂催化剂作用下，中间产物3在45°C下反应得到中间溴 化物4 ;
[0026] D、在镁、无水乙醚、甲酸乙酯催化剂作用下，中间产物4在40°C下发生格式反应生 成中间产物5 ;
[0027] E、在氢氧化钠、四氢呋喃作用下，中间产物5在65°C下发生水解反应生成中间产 物6〇
[0028] F、在N，N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰 二亚胺盐酸盐催化剂作用下，中间产物6在50°C下发生酯化反应产生中间产物8 ;
[0029] G、在二甲基甲酰胺、碘化钠、碳酸钾的催化剂作用下，中间产物8在80°C下与N-甲 基哌嗪发生氨基化反应，即得所述两亲性衍生物。
1-7中任一整数，且第6个碳原子处为单键或双键，第9个碳原子处为单键或双键。
[0031] 第三方面，本发明涉及一种含有上述的两亲性衍生物的脂质体，所述脂质体由所 述两亲性衍生物、胆碱、胆固醇组成；所述脂质体中胆碱的重量百分比含量为20%~50%， 胆固醇的重量百分比含量为10%~30%。所述胆碱优选二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC)。
[0032] 第四方面，本发明涉及一种上述的脂质体的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0033] A、将两亲性衍生物的乙醇溶液、胆碱乙醇溶液、胆固醇乙醇溶液混合，形成脂质乙 醇混合液；
[0034] B、将所述脂质乙醇混合液加入到pH〈5. 0的HEPES缓冲液中，搅拌，制得脂质体混 悬液；
[0035] C、将脂质体混悬液在pH〈5. 0的HEPES缓冲液透析，去除乙醇；即得所述脂质体。
[0036] 步骤B中，脂质体混悬液中含30wt. %乙醇。步骤C中，透析是在4°C下透析4h。
[0037] 第五方面，本发明涉及一种上述的脂质体在制备基因药物输送载体中的用途，所 述脂质体包载DNA、RNA、透明质酸或多肽。所述基因药物为DNA、RNA、透明质酸或多肽。该 脂质体具有帮助基因药物穿过细胞外障碍和细胞内障碍的能力。
[0038] 第六方面，本发明涉及一种脂质/基因复合物，所述脂质/基因复合物是由上述的 脂质体包载基因生物分子而组成的。其包封率在30%以上。该基因生物分子包括DNA、RNA、 透明质酸或多肽。
[0039] 第七方面，本发明涉及一种上述的脂质/基因复合物的制备方法，所述方法包括 如下步骤：
[0040] A、将两亲性衍生物的乙醇溶液、胆碱乙醇溶液、胆固醇乙醇溶液混合，形成脂质乙 醇混合液；
[0041 ] B、将所述脂质乙醇混合液加入到pH〈5. 0的HEPES缓冲液中，搅拌，制得脂质体混 悬液；
[0042] C、在所述脂质体混悬液中加入基因生物分子的DEPC水溶液，37°C孵育l_2h ;
[0043] D、在pH〈5. 0的HEPES缓冲液透析，去除乙醇；继续PBS溶液透析，调整体系pH至 中性，即得所述脂质/基因复合物。
[0044] 步骤B中，脂质体混悬液中含30wt. %乙醇。步骤D中，在HEPES缓冲液中透析是 在4°C下透析4h ;在PBS溶液中透析是在4°C下透析12h ;其中PBS溶液的pH值为7. 4。步 骤D中，优选调整体系pH至7. 4。
[0045] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0046] (1)本发明基于3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸结构为基础，制备的两亲性衍 生化合物，从而改善优化了传统基因递送系统合成步骤复杂，不易放大生产的问题；
[0047] (2)本发明的两亲性衍生物制备而成的脂质体，与基因药物siRNA复合后，能形成 粒径较小，分布均匀的复合物。同