法如实施例7,以MPZ/DPPC/Chol-(40/40/30mol)摩尔比 制备脂质体，按照N/P-20/1包裹荧光素酶luciferase-siRNA，制备脂质/基因复合物；
[0165] 2. H1299细胞收集与培养：
[0166] 人非小细胞肺癌H1299-pGL3细胞系由实验室传代获得[Differential enhancement of a Cutaneou HPV Promoter by A NP63 a Jun and Mutant p53. [Cell Cycle4:5, 689-696 ;May2005]，采用含 10 % 小牛血清的 RPMI1640 培养基于 37°C、5 % C02 培 养箱培养，2~4天更换培养基一次，1:3常规传代培养，取对数期细胞进行实验；
[0167] 3.复合物与细胞孵育：
[0168] 细胞在转染实验前24小时按105/Well接种于24孔板，18h后观察，约长到 70-80%。转染前用不含血清的培养基洗细胞一次，将样品用适量Opti-MEM培养基稀释，以 每孔400 iil/well加入24孔板。置培养箱中转染2. 5~4小时后，换成含血清培养基继续 培养36-48小时后，荧光素酶检测仪（Luminometer)检测（RLU)值，测量报告基因的表达， BCA蛋白含量测定计算细胞板每孔蛋白含量，同时用空白PBS组，裸siRNA组作为对照，考察 载体转染基因药物的能力；
[0169] 1)荧光素酶活力检测：
[0170] Luciferase报告基因的转染结果的检测步骤按照Luciferase Assay System的操 作说明测定，使用荧光素酶检测仪（Luminometer)检测相对发光值；
[0171] i .将5X CCLR(细胞裂解液）稀释成IX，取分装的荧光素酶底物（Luciferase Assay Substance)待其恢复室温使用；
[0172] ii.将转染后的细胞去除培养基后用PBS润洗3次，润洗后将孔中的PBS吸干，然 后每孔添加200 ill的IX细胞裂解液于37°C 30min ;
[0173] iii.充分裂解后将混合物移入离心管中，用13000rpm的转速离心3min，用上清液 作为检测样品；
[0174] iv .每个检测样品取10ii1与10ii1的突光素酶底物在检测管中充分混合（用 移液枪吹打10次）后放入突光素酶检测仪（Luminometer)中测定Luciferase的发光值 (RLU)。
[0175] 2) BCA蛋白含量测定法：
[0176] 每孔细胞蛋白浓度的检测步骤按照BCA Protein Assay Kit的操作说明测定，使用 酶标仪检测光密度（OD)值；
[0177] i.绘制标准曲线；
[0178]ii.配置BCA工作试剂（WR)，在96孔板中每孔加入200 的WR，然后像孔中加 入10 Ul样品或者上述离心后的上清检测样品；
[0179] iii.加入样品后，将96孔板至于37°C恒温恒湿箱中放置30min使其充分反应，再 用酶标仪在562nm处测量光密度（OD)值；
[0180] iv .根据标准样品的光密度值绘制标准曲线，然后根据标准曲线拟合得到回归方 程计算检测样品中的蛋白质含量。
[0181] 效果验证：
[0182] (l)MPZ/luciferase_siRNA复合物粒径分布及均一度结果如表7所示；
[0183] (2) MPZ/luciferase-siRNA复合物转染H1299-pGL3细胞，基因沉默结果如图10所 示；
[0184] (3)MPZ/luciferase-siRNA 复合物转染 H1299-pGL3 细胞，BCA 蛋白结果如图 11 所 示；
[0185] 由结果中可以看出，经MPZ两亲性化合物制备的脂质体包裹siRNA进入了细胞，并 特异性沉默了目的基因，与PBS空白对照及裸siRNA组相比较，大大提高了基因沉默的效 率。而细胞蛋白BCA实验结果显示，与空白对照PBS与siRNA组相比，MPZ脂质体包裹siRNA 制剂蛋白BCA水平相近，并未造成细胞毒性。
[0186] 表 7
[0187]
[0188] 实施例1KMl脂质体/某因复合物人肺癌H1299-DGL3细朐转染效果
[0189] 本实施例利用Ml脂质制备的脂质体/luciferase-siRNA复合物对人非小细胞肺 癌H1299细胞进行细胞转染，由其基因沉默效果，来观察载体脂质对基因药物的转运情况。
[0190] 1.脂质/基因复合物的制备：
[0191] Ml/基因复合物制备方法如实施例8,以Ml/DPPC/Chol-(40/20/40mol)摩尔比制 备脂质体，按照N/P-20/1包裹荧光素酶luciferase-siRNA，制备脂质/基因复合物；
[0192] 2. H1299细胞收集与培养方法如实施例10 ;
[0193] 3.复合物与细胞孵育及测定方法如实施例10 ;
[0194] 效果验证：
[0195] (l)Ml/luciferase_siRNA复合物粒径分布及均一度结果如表8所示；
[0196] (2)Ml/luciferase-siRNA复合物转染H1299-pGL3细胞，基因沉默结果如图12所 示；
[0197] (3)Ml/luciferase_siRNA 复合物转染 H1299_pGL3 细胞，BCA 蛋白结果如图 13 所 示；
[0198] 由结果中可以看出，经Ml脂质制备的脂质体包裹SiRNA进入细胞后，特异性沉默 了目的基因，与PBS空白对照及裸SiRNA组相比较，大大提高了基因沉默的效率。而细胞蛋 白BCA实验结果显示，与空白对照PBS与siRNA组相比，TMEA脂质体包裹siRNA制剂蛋白 BCA水平相近，并未造成细胞毒性。
[0199] 表 8
[0200]
[0201] 实施例12、M2/某因复合物人肺癌H1299-DGL3细朐转染效果
[0202] 本实施例利用M2两亲性化合物制备的脂质体/luciferase-siRNA复合物对人非 小细胞肺癌H1299细胞进行细胞转染，由其基因沉默效果，来观察载体脂质对基因药物的 转运情况。
[0203] 1.脂质/基因复合物的制备：
[0204] M2脂质/基因复合物制备方法如实施例9,以M2/DPPC/Chol-(40/30/40 mol)摩尔 比制备脂质体，按照N/P-20/1包裹荧光素酶luciferase-siRNA，制备脂质/基因复合物；
[0205] 2. H1299细胞收集与培养方法如实施例10 ;
[0206] 3.复合物与细胞孵育及测定方法如实施例10 ;
[0207] 效果验证：
[0208] (I)M2脂质/luciferase-siRNA复合物粒径分布及均一度结果如表9所示；
[0209] (2)M2脂质/luciferase-siRNA复合物转染H1299-pGL3细胞，基因沉默结果如图 14所示；
[0210] (3)M2脂质/luciferase-siRNA复合物转染H1299-pGL3细胞，BCA蛋白结果如图 15所示；
[0211] 由结果中可以看出，经M2脂质制备的脂质体包裹siRNA进入细胞后，特异性沉默 了目的基因，与PBS空白对照及裸siRNA组相比较，大大提高了基因沉默的效率。而细胞蛋 白BCA实验结果显示，与空白对照PBS与siRNA组相比，TMEA脂质体包裹siRNA制剂蛋白 BCA水平相近，并未造成细胞毒性。
[0212] 表 9
[0213]
[0214] 实施例16、鉬织切片后共聚隹显微镜观察MPZ/Cv-5-siRNA复合物在肝内分布
[0215] 本实施例利用MPZ两亲性衍生物制备的脂质体包裹Cy-5-siRNA制备的脂质/ siRNA复合物，动物给药后，肝脏组织切片后，共聚焦显微镜下观察MPZ脂质/siRNA复合物 分布，从而探知载体脂质对基因药物的转运情况。
[0216] I. MPZ脂质/Cy5_siRNA复合物制备：MPZ脂质/Cy5_siRNA复合物制备方法及比例 如实施例7 ;
[0217] 2.组织切片
[0218] (1)取材：取成年健康ICR小鼠20g，尾静脉注射MPZ脂质/Cy5_siRNA复合物 200^，约10^0 75-811^，411后，颈椎脱臼，解剖，取出肝脏；
[0219] (2)速冻：将取出的肝脏修成小块，置于OCT中包埋，迅速置于液氮中速冻，成块后 立即转移至冰冻切片机，准备切片；
[0220] (3)切片：将冰冻切片机恒温箱调至-25度，将包埋块沿切片方向修整成长方形或 正方形，并将修整后的组织小块放入标本盘中，切片厚度调至20 y m，连续切片，直接用预 处理后的载玻片粘片，并放入多聚甲醛中固定5min;
[0221] (4)漂洗：将固定后的切片转移至装有IxPBS的染色缸中，漂洗3min，漂洗3次；
[0222] (5)封闭：将漂洗后的切片用擦镜纸擦干组织周围的水分，用免疫组化笔在组织 周围画圈，加入5%的Donkey serum,于湿盒内37摄氏度封闭30min ;
[0223] (6) -抗孵育：吸收封闭液，立即加入稀释好的一抗，于湿盒内37度封闭12_16h ;
[0224] (7)二抗孵育：吸掉一抗，加入稀释好的二抗，于湿盒内37度孵育约30min;
[0225] (8)DAPI染色：吸掉二抗稀释液，加入DAPI，于湿盒内37摄氏度孵育约30min;
[0226] (9)封片：用Ve