作为PPAR-γ调节剂的氨基嘧啶衍生物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物化学领域，具体涉及到权利要求中所述的一种氨基嘧啶衍生物及 其生理上可接受的盐，它们的制备以及它们在治疗和/或预防与炎症（包括类风湿性关节 炎）、动脉粥样硬化、I型或II型糖尿病、糖尿病并发症、肥胖、高脂血症、糖耐量损害、脑缺 血、帕金森综合症、胰岛素抵抗以及骨质疏松症相关的疾病中的用途。 技术背景
[0002] 过氧化物酶增殖物激活受体（peroxisomeproliferator-activatived receptors，简称PPAR)是一类配体激活的转录因子，属于核激素受体超家族，包括 PPAR-a、PPAR- 0S和PPAR-y三种表型，其中以PPAR-y的研究最为深入。PPAR的激活 对调节体内极广泛的代谢过程具有不可替代的作用。
[0003] 过氧化物酶（peroxisome)是体内一种亚细胞结构，其功能包括清除分子氧和氢 过氧化物，并与糖、脂、胆固醇、胆酸的合成及脂肪酸氧化有关。一系列的天然或人工合成 的脂肪酸类化学物质可以刺激过氧化物酶的增殖，称为过氧化物酶增殖物（peroxisome proliferation)。过氧化物酶增殖物可以激活其受体，从而引发一系列的生物学作用，所以 把这一类受体称为过氧化物酶增殖物激活受体（PPAR)。在人体内激活PPAR后产生多种生 物学作用，如调节脂质的代谢，提高胰岛素的敏感性，抗肿瘤作用，保护神经元，抑制炎症反 应等。明确这些相关信号通路以及相关细胞因子的作用，可对相关疾病机制及防治进一步 提供有力依据和干预途径。
[0004] 一、PPAR的结构
[0005] 关于PPAR的结构，MarxN等人在Circ.Res. (2004, 94 (9): 1168-1178)中报道， PPAR是一种配体激活的转录因子，属于核激素受体超家族，参与多种代谢过程中的基因调 控。PPAR有3种亚型a，0，丫，其基因分别位于人类第22,6和3号染色体上。PPAR的 结构包括4个功能区：N端的A/B区是不依赖配体的转录活化区，各亚型的该区结构差别明 显，它的丝氨酸残基受丝裂原激活蛋白激酶（MAPK)磷酸化后可抑制受体的活性；C区具有 高度的保守性，其中70个左右的氨基酸序列构成了DNA结合区（DBD)，用于和目标基因上 的PPAR反应元件（PPRE)结合；D区又称为铰链区（hingedomain)，将DBD与配体结合区相 连；C端的E/F区是配体结合区（LBD)，该区氨基酸序列的不同使各亚型的PPAR分别对不同 配体产生亲和力，即与配体形成二聚体。
[0006] PPAR的配体在结构上有一个共同点，含有羧基功能基团和一个疏水区（Marx N，DuezH，FruchartJC，etal.Circ.Res. ,2004, 94 (9): 1168-1178)。PPAR的配体分为合 成配体和天然配体。合成配体主要是一些药物。天然配体主要来源于饮食和机体的代谢 产物，如亚油酸、花生四烯酸及其衍生物白三烯B4(LTB4)、8(S)羟基二十碳四烯酸[8(S) 册丁￡]、15-脱氢前列腺素12(15-(1^^^2)。人类？?41?-€[有468个氨基酸残基，？?41?-0有 441个氨基酸残基，PPAR-y有479个氨基酸残基。PPAR3种亚型的结构有60%~80%的 同源性，但它们的配体和目标基因有明显的不同。PPAR-a的配体包括白三烯B4和贝特类 降脂药，主要调节脂质的代谢。PPAR-0的配体为多聚不饱和脂肪酸、前列腺素和视黄酸等。KuenzliS等人在Br.J.Dermatol. (2003, 149 (2): 229-236)中报道PPAR-0 在人类角质形 成细胞上的表达与皮肤疾病相关。PPAR-y的配体为罗格列酮（rosiglitazone)、R比格列酮 (pigoglitazone)等噻唑烷二酮类化合物及15-脱氢前列腺素J2,调节糖原和脂肪的代谢。
[0007] 二、与PPAR相关的疾病
[0008] (一）PPAR与炎症
[0009]PPAR-y可通过竞争抑制炎症信号通路和炎症介质的生成起到抑制炎症反应的 作用，相关的炎症信号通路主要包括四种，分别是JAK-STAT、NF-kB、活化T细胞核因子 (nuclearfactorofactivatedTcell,NFAT)以及AP_l〇
[0010] JAK-STAT信号转导途径始于JAK-2磷酸化后激活，激活的JAK-2再激活JAK-1， 继而在JAK-1的作用下，STAH和STAT2分别被激活，前者形成同源二聚体后须与协同活化 因子CREB结合蛋白（CBP)或p300结合后才能在细胞核内发挥其生物学活性。当PPAR-y 与配体结合并激活后，PPAR-y-RXR异二聚体竞争、招募结合数量有限的协同活化因子CBP 及P300,造成能够与STAH结合的协同活化因子数量减少，从而抑制了STAH的活化，并 阻断了STAT相关的促炎症细胞因子（IL-6,IL-1，TNF-a)的生成（LiM，etal.MolCell Biol, 2000, 20:4699)。在炎症反应中，INF-y与PPA-y相关信号密切相关。有报道，IFN-y 刺激后可诱导并活化从1(/3了41'通路，使了即-€[、11^10产生增多（1^0,6丨&1.似七1^￥ Immunol, 2002, 2:725)。在大鼠巨噬细胞和人DLD1细胞中，IFN-y等通过激活JAK2和下 游的STAH和STAT3,增强诱导一氧化氮合酶（iNOS)表达并加重炎症反应。在上述反应中， iNOS在内毒素刺激下可诱导细胞过表达N0,后者可直接损伤细胞DNA，使其发生断裂，以致 细胞凋亡（BohrerH,etal.JClinInvest, 1997, 100:972)。而PPAR-y通过抑制JAK-STAT 途径，阻断了IFN-y的促炎作用。
[0011] NF-kB有p50和p65两个亚基。在静息细胞中，NF-kB与抑制蛋白单 体IicBa和IkB0以无活性结合形式存在于细胞质（GhoshS，etal.AnnuRev Immunol, 1998, 16:225)。在炎症反应中，促炎症因子与IkB两个丝氨酸残基（a，)结合， 使得IkBa/ 0泛素化并被降解，而致p50/p65二聚体与IkBa/ 0解离。解离的二聚体 再与协同活化因子P300和CBP结合后在核内与DNA特定的kB序列结合，一方面可以诱导 其他炎症介质基因表达，同时还可以增加C0X-2作用。C0X-2在炎症反应中可以促使花生四 稀酸向PGH2转化，而PGH2又可以生成PGE2,介导炎症介质的生成（StrausDS,etal.Proc NatlAcadSciUSA, 2000, 97:4844)。PPAR-y可以直接与NF-kB的亚基p65/p50 结合， 发生蛋白质-蛋白质相互作用，形成转录抑制复合物，降低了NF-kB与DNA结合活性，抑 制NF-kBDNA合成，从而抑制其表达（ChungSW，etal.JBiolChem, 2000, 275:32681)。 PPAR-y还可以通过与竞争结合协同活化因子p300和CBP来抑制NF-kB的转录。在大 鼠结肠炎的模型中，应用PPAR-y激动剂罗格列酮，可以观察到大鼠组织中C0X-2、PGE2、 TNF-a等炎症介质表达显著减少，证实了上述说法（Sanchez-HidalgoM，etal.Biochem Pharmacol, 2005, 69:1733) 〇
[0012] NFAT主要在T细胞以及其他免疫细胞，如B细胞、NK细胞、肥大细胞等表面表 达。NFAT在细胞质中以无活性的磷酸化状态存在，受到|丐调神经磷酸酶（calcineurin)等 激活因子激活以后，脱磷酸化而激活并转位至细胞核内，发挥作用。StrausDS等人发现， PPAR-y在T细胞介导的炎症反应中通过影响NFAT途径来抑制IL-2的基因表达。PPAR-y可通过配体阻抑NFAT的DNA结合和转录活性，阻抑NFAT调节T细胞IL-2启动子。PPAR-y 与NFAT之间通过蛋白质-蛋白质相互作用来抑制T细胞在炎症中的活化，并下调IL-2启 动子，从而发挥抑制炎症的作用（ProcNatlAcadSciUSA，2000, 97:4844)。
[0013] AP-1是一种核转录因子。典型的AP-1复合物由c-Jun和c-Fos两个亚单位组成， 通过亮氨酸与DNA结合。在炎症反应中，AP-1具有诱导细胞的凋亡、黏附因子和炎症因子 的合成等功能（StrausDS，etal.ProcNatlAcadSciUSA，2000,97:4844)。PPAR-y通 过与AP-1竞争结合协同活化因子CBP和p300,起到对AP-1信号转导途径的抑制作用，这一 机制与PPAR-y影响JAK-STAT的途径相类似。（二）PPAR与代谢综合征 [0014] 糖尿病是由多种病因引起以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，主要由于胰岛素分泌 或作用的缺陷，或者是两者同时存在引起。胰岛素抵抗是代谢综合征的中心环节，PPAR-y对糖代谢的调节主要是增加外周组织对胰岛素的敏感性，从而改善胰岛素抵抗。PPAR-y功 能受损会导致严重的胰岛素抵抗，而合成的PPAR-Y激动剂噻唑烷二酮类药物包括曲格列 酮（troglitazone)、罗格列酮、吡格列酮可以有效改善2型糖尿病患者的胰岛素敏感性并 降低血糖（DemgT,ShanS,LiPP,etal.Endocrinology, 2006, 147(2) : 875-884)。PPAR-y 增加胰岛素敏感性的机制可能是：磷脂酰肌醇3激酶（PI3K)是靶细胞介导葡萄糖进入细 胞内的关键性脂质激酶，由一个调节亚基和催化亚基组成，P13K是一种脂质激酶，由一个 调节亚基和催化亚基组成。调节亚基与胰岛素受体底物（IRS)相结合，结合后由IRS催化 细胞膜上磷脂酰肌醇（PI)的磷酸化。静息状态时，调节亚基与催化亚基起抑制作用，在胰 岛素刺激下，IRS与调节亚基结合，其抑制作用解除，即活化催化亚基。P13K激活后，分别 可促使PI、磷脂酰肌醇-磷酸（PIP)和磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2)磷酸化生成PIP、PIP2或 PIP3。这些产物被认为是胰岛素及其他生长因子第二信使，其中以PIP3最为重要。PPAR-y 在PI3K信号通路中可以促进PI3K基因表达，增强胰岛素的敏感性，还可增强葡萄糖转运体 4(GluT4)基因表达，促进对葡萄糖的摄取；PPAR-y活化可以加速甘油三酯在外周组织的 分解，增加其在脂肪组织中的合成，抑制胰高血糖素的生成。
[0015] 脂滴包被蛋白（perilipin)可以减少甘油三酯水解，在调节脂质的储存和代谢中 起着重要作用。噻唑烷二酮类（TZD)药物作为PPAR-y激动剂可明显减少TNF-a导致的 脂肪分解，也可以明显阻止TNF-a引起的perilipin减少。进一步研究表明，perilipin基 因启动子区域包含有功能性的PPAR-y反应元件，PPAR-y激动剂可以明显增加perilipin 基因表达，从而调控脂肪的分解。也有报道说PPAR-Y调节脂质代谢是由于在肝细胞和前 脂肪细胞中，PPAR-Y激动剂上调了激素敏感性脂肪酶（HSL)的基因表达。其机制可能是： PPAR-y启动子区域包含两个GC盒，PPAR-y介导的转录活性由其近侧的启动子来实现。 内源性的PPAR-y增强转录因子SP1和启动子结合，激活转录活性，从而使HSL基因表达上 调（DemgT，ShanS，LiPP，etal.Endocrinology, 2006, 147 (2): 875-884)。另外，PPAR-a 激动剂能降低血中甘油三酯，增加高低密度脂蛋白，前者是通过控制多种基因的转录调节 来增加脂肪的吸收、活化和代谢，后者是通过促进肝脏载脂蛋白A-I(apoA-I)和载脂蛋 白A-II(apoA-II)的产生来介导。
[0016] (三）PPAR与动脉粥样硬化
[0017] 动脉粥样硬化是一个由动脉血管壁粥样斑块进行性积聚，是一种血管的慢性炎症 反应，与C反应蛋白、纤维蛋白原、TNF-a和IL-6增加有关，最终导致局灶性动脉阻塞的 病理过程。前者主要涉及3个病理过程，即泡沫细胞（foamcell)的分化、炎症反应以及 细胞增殖。在病变早期，通常有单核/巨噬细胞和T细胞的聚集，而进展期可见富含脂质 单核/巨噬细胞来源的泡沫细胞增多，以及血管平滑肌细胞（VSMC)迀移增殖，细胞碎肩堆 积，以致粥样斑块纤维帽生成。由此在动脉内膜可诱发与动脉粥样硬化相关的局部炎症反 应（DesvergneB，etal.EndocrRev，1999,20:649)。近来发现，在人类和小鼠粥样斑块 损伤中可见PPAR-y明显表达，提示PPAR-y在粥样硬化中起重要作用（TontonozP，et al.Cell，1998, 93:241)。PPAR-a激活后通过不同机制抑制动脉粥样硬化的形成：（1)改善 早期血管壁的反应性，防止脂质在血管壁的沉积和浸润。（2)减少内皮细胞表面粘附分子 的表达，减少炎症细胞因子，从而减轻白细胞的粘附聚集反应。（3)粥样斑块形成的后期， PPAR-a激动剂使斑块的稳定性加强，防止脱落，减少心脑血管意外。（4)纠正脂质代谢紊 乱，防止粥样斑块的形成。
[0018] 己知炎症反应在动脉粥样硬化发生发展中起重要作用。在上述病理改变中， PPAR-y通过对转录因子的抑制作用来抑制炎症反应，减轻动脉粥样硬化的病理损伤。包 括PPAR-y通过抑制AP-1介导的信号通路，抑制由凝血酶诱导的人血管内皮细胞内皮素 1 的合成（DeleriveP，etal.CircRes, 1999,85:394);亦可通过影响NF-kB信号途径， 抑制TNF-a诱导的内皮细胞血管细胞黏附分子-l(VCAM-l)的表达，进而调抑单核细胞 于早期动脉粥样斑块形成处的聚集（MarxN，etal.Circulation, 1999, 99:3125);而抑制 黏附分子ICAM-1、E-选择素等，可以抑制炎症细胞的募集和浸润（VerrierE，etal.Circ RPJ，2004, 94:1515)。总之，在动脉粥样硬化的慢性炎症过程中，PPAR-y可以下调黏附分 子的表达，减少炎症细胞聚集。一方面可以减少炎症介质的释放；另一方面可以抑制单核/ 巨噬细胞向泡沫细胞的转化。
[0019]内皮素是一种从内皮细胞分离的内皮缩血管肽，可诱导平滑肌细胞的增生。动脉 内内皮素的释放增加，会诱导血管痉挛和粥样斑块的形成。匹立尼酸（WY14643,PPAR-a配 体）和罗格列酮可抑制内皮素的分泌和氧化修饰低密度脂蛋白（0X-LDL)诱导的蛋白激酶 C，减少动脉粥样硬化的形成。另外，15-脱氢前列腺素J2或环格列酮（ciglitazone)可增强 N0从肺动脉和主动脉的释放，保护血管壁（CalnekDS，MazzellaL，RoserS，Arterioscler Thromb.Vase.Biol. ,2003, 23(1):52-57)〇
[0020] (四）PPAR与肿瘤
[0021] PPAR与肿瘤的关系已受到普遍的关注，PPAR-y能调节组织中细胞的增殖、分化 及凋亡：（l)PPAR-y受体激动剂能导致G1期细胞周期停滞，抑制细胞增殖。FarroW等人 在胰腺癌的研究中发现，激活PPAR-y后可以上调PTEN，从而抑制PI-3K信号途径中Akt 的磷酸化，使得胰腺肿瘤细胞周期静止于GQ/Gji3(FarrowB，etal.BiochemBiophysRes Commun，2003, 301:50)。在肝癌细胞的研究中，研究人员发现PPAR-y可以通过上调p21Gipl/ '^1或卩271<1|5来抑制细胞的增殖〇((^3 11，6七31.11印&仂1(^7,2001，33:1087)。？21叫1/'^1 或p27kip可以抑制细胞周期调节蛋白一DK复合物的活性，而该复合物可调节细胞周期的进 程。Jung等研究指出，p21eipl/Wafl或p27kip至少部分参与了环格列酮对宫颈癌C-4II株细 胞生长的抑制（JungTI，etal.GynecolOncol, 2005, 97:365)。噻唑烧二酮类药物可作 用于周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK)抑制因子，如P18,P21。研究发现PPAR-y激动剂可 使P18和P21表达上调，这些因子可以通过减少细胞周期蛋白（cyclin)与⑶K复合体的 形成而降低成视网膜母细胞瘤蛋白（Rb蛋白）的磷酸化作用，促使肿瘤细胞G1期生长停 滞，最终阻遏细胞的增殖周期，从而达到抗肿瘤增殖效应。（2)PPAR-y激动剂可以诱导细 胞凋亡。PPAR-y在肿瘤的发生发展中通过诱导细胞的凋亡，参与细胞周期的调控来发挥 作用。研究发现，c6胶质瘤细胞在PPAR-y激动剂作用下，前凋亡蛋白Bax和Bad表达上 调，导致细胞色素C的释放，引起一系列caspase家族因子的激活，最终引起肿瘤细胞的凋 亡。（3)PPAR-y激动剂还可通过抑制肿瘤新生血管的形成而产生抗肿瘤作用。PPAR-y被 激活后可通过其下游目的基因，如抑癌基因（PTEN)、原癌基因（c-myc)、p27、C0X-2和间质 金属蛋白酶9 (MMP9)等，实现其抑制细胞生长、诱导细胞凋亡，以及诱导肿瘤细胞分化和抑 制肿瘤血管形成等生物学功能。相关研究指出，激活的PPAR-y可以通过抑制血小板源生 长因子，膜岛素诱导微型染色体维持蛋白（insulininducedminichromosomemaintenance protein)以及E2F信号，以此对细胞周期和DNA的复制起到抑制作用（BruemmerD，et al.EurJPharmacol，2003,466:225)。（4)PPAR-y激动剂可以抑制癌细胞转移。LiuH等人 (LiuH，ZangC，FennerMH，etal.BreastCancerRes.Treat. ,2003, 79(1): 63-74)报道， 基质金属蛋白酶（MMP)尤其是明胶酶（gelatinase)的表达增加与肿瘤形成相关。PPAR-y 的活化可以抑制明胶酶B，并可阻止巨噬细胞和肌细胞迀移，提示PPAR-y配体可能有抑制 肿瘤细胞转移的作用。PPAR-y配体也可上调组织抑制性MMP-1 (HMP-1)，使明胶酶的明胶 分解作用下降，防止癌细胞发生转移。在黑素细胞瘤及其转移灶上也有PPAR-y的表达， 曲格列酮和罗格列酮可抑制黑素细胞瘤细胞的增殖分化，可用来治疗黑素细胞瘤（Mossner R,SchulzU,KrugerU,etal.JInvest.Dermatol. , 2002, 119(3):576-582)〇
[0022] (五）PPAR与脑缺血
[0023] Shimazu等研究表明PPAR-y的激活可增加铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD)，清 除自由基（ShimazuT，InoueI，ArakiN，etal.Stroke, 2005, 36 (2): 353-359)。PPAR-y 的激活可以保护脑缺血再灌注中神经元损伤。另外，脑缺血后炎症反应的损伤作用已受到 人们的关注。树突状细胞是一种重要的抗原提呈细胞，通过释放细胞因子参与脑缺血后 的炎症损伤。PPAR-y激动剂环格列酮可减轻0X-LDL诱导的树突状细胞的表达，抑制树 突状细胞的入胞作用，减少树突状细胞所引发的免疫反应，减少脑缺血后的炎症反应（Luo Y，LiangC,XuC，etal.JCardiovascPharmacol, 2004, 44 (3): 381-385)。由于PPAR与脑 缺血再灌注损伤密切相关，可以PPAR为靶点寻找神经元保护剂。
[0024] (六）PPAR与帕金森病
[0025] DehmerT等人在JNeurochem(2004, 88 (2) : 494-501)中研究发现，PPAR-y在帕金 森病病人的黑质纹状体中有表达。在MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2, 3,6-四氢吡啶）诱导的 帕金森病模型中，诱导型一氧化氮合酶（iNOS)催化产生N0,作为一种重要介质调节多巴胺 神经元细胞的死亡。吡格列酮可以保护MPTP诱导的纹状体中多巴胺神经元细胞的丢失以 及儿茶酚胺的丢失。口服吡格列酮可保护黑质神经元的酪氨酸羟化酶的活性，可减少黑质 纹状体致密部小胶质细胞的活性，减少胶质纤维酸性蛋白的活性。另外，吡格列酮可减少N0 介导的细胞损伤。其机制可能是由于抑制NF-kB亚单位p65转入胶质细胞和多巴胺神经 元的核内，从而发挥细胞保护作用。
[0026] (七）PPAR与皮肤疾病
[0027] 研究表明，PPAR-0在表皮伤口愈合的过程中起到决定性作用。PPAR-0对调节 皮肤表皮细胞的生长分化和皮肤炎症反应有重要的作用。PPAR-P与银肩病、特应性皮炎、 痤疮及皮肤的愈合有关（K