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[0048] 在某些实施方案中，根据本发明的细菌是保藏号为12082901的细菌的变体或后 代。
[0049] 生物型B
[0050] 发明人发现在鲶形目、鲈形目和鲤形目鱼中的攻击研究中，基于生物型B嗜水气 单胞菌细菌的免疫组合物完全防护生物型B，并提供令人满意的针对生物型B的抗体应 答。
[0051]因此，作为第二个主要方面，本发明涉及分离的嗜水气单胞菌生物型B细菌，所述 细菌选自以下组：
[0052] (i)根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布 达佩斯条约"保藏于英国SP40JG威尔特郡索尔兹伯里市波顿镇的健康保护局培养物中心 (HealthProtectionAgencyCultureCollections,PortonDown,Salisbury,Wiltshire, SP40JG，UK)的保藏号为12082902的细菌；
[0053] (ii)能够与来自用i)中限定的细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。
[0054] 发明人还能够确立以上限定的生物型B菌株的基因型和表型特征。因此，本发明 还涉及具有基因型和/或表型特征的细菌，所述特征与以上限定的保藏的生物型B细菌的 特征相关。
[0055] 另外，已经证实以上限定的生物型B细菌能够在感染的鱼中诱导特定的临床症 状。因此，本发明还涉及细菌，其中所述表型特征包括在重10_20g的鱼中经腹膜内注射 100-6000cfu/鱼的量以及0.Iml的注射体积时，在巨鲶（巴丁鱼）中诱导败血病，并且任选 地，诱导死亡的临床症状的能力。
[0056] 因此，在其他方面中，本发明还涉及以上限定的生物型B的细菌，其中所述表型特 征包括在重10_20g的鱼中经腹膜内注射较少的100-6000cfu/鱼的量以及0.Iml注射体积 的所述细菌后的2-5天内，在巨鲶（巴丁鱼）中诱导败血病，并且任选地，诱导至少50%死 亡的临床症状的能力。
[0057] 以上限定的生物型B细菌在巨鲶中诱导死亡的能力可以是造成至少50%、至少 60%、至少70%、至少80%、或例如至少90%或100%死亡的能力。
[0058] 特别地，根据以上实施方案的鱼可以具有例如10_20g、12_19g、14_19g、16_19g、 17-18g或18g的重量。另外，以上实施方案可应用于初始重量为5g的鱼，并且可在生产周 期中进一步应用。
[0059] 另外，在以上实施方案中的注射细菌量可以是100-6000cfu/鱼、200-5000cfu/ 鱼、300-4000cfu/ 鱼、400-3000cfu/ 鱼、500-2000cfu/ 鱼、600-1000cfu/ 鱼或低于 500cfu/ 鱼。
[0060] 发明人还证实，以上限定的用于本发明的感兴趣的细菌可以与保藏的生物型B菌 株的两种特定的经测序基因具有一定水平的相同性。因此，在本发明的另一个方面中，以上 限定的生物型B细菌显示出以下基因型特征：其具有甲硫氨酰-tRNA合成酶（metG)基因， 该基因包含与SEQIDN0:3所示序列至少99%相同的序列，和/或柠檬酸合酶（gltA)基 因，该基因包含与SEQIDNO: 4所示序列至少99%相同的序列。
[0061] 特别地，以上限定的生物型B细菌显示与SEQIDNO: 3所示序列99. 1 %-99. 2%、 99. 2%-99. 3%,99.3%-99. 4%,99.4%-99. 5%,99.5%-99. 6%,99.6%-99. 7%, 99. 7% -99. 8%、99. 8% -99. 9%、99. 9% -100%的相同性。
[0062] 另外，以上限定的生物型B细菌显示与SEQIDN0:4所示序列99. 1 %-99. 2%、 99. 2%-99. 3%,99.3%-99. 4%,99.4%-99. 5 %^99, 5%-99. 6 %^99, 6 % -99. 7 %^ 99. 7% -99. 8%、99. 8% -99. 9%、99. 9% -100%的相同性。
[0063] 如上所述，发明人另外证实以上限定的用于本发明的感兴趣的生物型B细菌的血 清型特征。因此，在其他方面，本发明涉及以上限定的细菌，其特征在于其与来自用以上鉴 定的保藏的生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应的能力，由上述直接凝集试验或玻片凝集 试验确定。
[0064] 在某些实施方案中，根据本发明的细菌是保藏号为12082902的细菌的变体或后 代。
[0065] 组合物
[0066] 发明人发现了基于生物型A嗜水气单胞菌的免疫原性组合物和基于生物型B嗜水 气单胞菌的免疫原性组合物，并在鲶形目、鲈形目和鲤形目鱼中的攻击研究中提供分别针 对生物型A和B的令人满意的抗体应答和充分保护。在这一点上令人惊讶的发现在于发明 人实现了将两种菌株组合在一种疫苗中，当用两种生物型的嗜水气单胞菌（即（i)免疫原 性含量的任意嗜水气单胞菌菌株，其例如能够与来自由根据"1977年4月28日的国际认可 的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约"保藏的保藏号为12082901的菌株代表 的嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应，以及（ii)免疫原性含量的任意嗜水 气单胞菌菌株，其例如能够与来自由根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目 的的微生物保藏的布达佩斯条约"保藏的保藏号为12082902的菌株代表的嗜水气单胞菌生 物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应）免疫鱼时，所述免疫抑制似乎被中和。嗜水气单胞菌 菌株如本文之前所述。
[0067] 因此，作为第三个主要方面，本发明涉及包含免疫原性含量的细菌和/或由此来 源的抗原性和/或免疫原性材料的组合物。
[0068]因此，在一个实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含免疫原性含量的嗜水气 单胞菌细菌，所述细菌能够与来自由根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目 的的微生物保藏的布达佩斯条约"保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生 物型A细菌或其来源的抗原性和/或免疫原性材料免疫的鱼的抗血清反应；或包含来自所 述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
[0069] 在其他实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含免疫原性含量的嗜水气单胞 菌细菌，所述细菌能够与来自由根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的 微生物保藏的布达佩斯条约"保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型 B细菌免疫的鱼的抗血清反应；或包含来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
[0070] 所述组合物可以是单价免疫原性组合物，特征在于其包含：
[0071] (i)权利要求1-6任意项中限定的单个生物型A细菌菌株或包含来自所述细菌的 抗原性和/或免疫原性材料；或者
[0072] (ii)权利要求7-12任意项中限定的单个生物型B细菌菌株或包含来自所述细菌 的抗原性和/或免疫原性材料。
[0073] 在其他实施方案中，本发明提供一种组合物，包含：
[0074] (i)抗原性和/或免疫原性材料，选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌，所述细 菌能够与来自由根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的 布达佩斯条约"保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的 鱼的抗血清反应，以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料；
[0075]和
[0076] (ii)抗原性和/或免疫原性材料，选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌，所述 细菌能够与来自由根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏 的布达佩斯条约"保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫 的鱼的抗血清反应，以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
[0077] 已经能够证实以上限定的生物型A和B细菌的血清型特征，因此，本发明的另一 实施方案涉及以上限定的组合物，其中所述嗜水气单胞菌细菌能够与来自用如上限定的嗜 水气单胞菌生物型A或B免疫的鱼的抗血清反应，并且其中所述组合物特征在于免疫原性 含量的所述嗜水气单胞菌细菌是减毒活的、灭活的或杀死形式或其任意混合。
[0078] 在鱼类养殖领域，疫苗的施用通常要求频繁地处理鱼，例如将鱼麻醉转移至水槽， 用疫苗注射鱼并随后在水槽或养鱼池之间转移鱼。这些只是与疫苗接种程序相关活动的实 例，其会对养殖鱼潜在地造成压力及增加的死亡率。由于现代水产养殖的大规模，疫苗接种 程序昂贵、劳动密集且能够对鱼造成压力。出于这些原因，期望提供针对不同传染病的鱼疫 苗，优选以例如组合、多价疫苗形式施用，其含有能够对抗几种传染病的几种抗原。
[0079] 在这方面，发明人进一步证实将属于生物型A或B的嗜水气单胞菌的分离物与其 他抗原，例如但不限于鲶鱼爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌（Edwardsiellatarda)、柱状黄 杆菌（Flavobacteriumcolumnaris)、海膝链球菌（Streptococcusiniae)、无乳链球菌 (Streptocossusagalactiae)、停乳链球菌（Streptococcusdysgalactiae)、副乳房链球 菌（Streptococcusparauberis)在例如免疫原性组合物或疫苗中组合能够在由所述抗原 攻击的鱼中提供有效的免疫应答。已经证实其中来自（i)嗜水气单胞菌生物型A的抗原与 鲶鱼爱德华氏菌组合以及来自（ii)嗜水气单胞菌生物型B的抗原与鲶鱼爱德华氏菌组合 的免疫原性组合物或疫苗，防止属于生物型A和生物型B的嗜水气单胞菌以及鲶鱼爱德华 氏菌的攻击。
[0080] 因此，在本发明另一个方面，以上限定的组合物特征在于免疫原性含量的所述嗜 水气单胞菌细菌与一或多种其他抗原组合，例如来自细菌鲶鱼爱德华氏菌、迟钝爱德华氏 菌、柱状黄杆菌、海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、副乳房链球菌的抗原。
[0081 ] 进一步经证实，例如通过本发明的免疫原性组合物或疫苗免疫的鱼中的有效的免 疫效应要求最小量的抗原。
[0082] 因此，在本发明另一个实施方案中，以上限定的组合物特征在于（i)嗜水气单胞 菌细菌以多IO7细菌/ml的量存在，和/或（ii)能够与来自由嗜水气单胞菌生物型A细菌 免疫的鱼的抗血清反应的嗜水气单胞菌细菌以多IO7细菌/ml的量存在，和/或（iii)能够 与来自由嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应的嗜水气单胞菌细菌以多IO7 细菌/ml的量存在。
[0083] 在系统发生比较研究中，基于24种菌株（11种菌株来源于PHARMAQ，13种为可公 开获得的参考菌株），本发明人能够证实本发明的感兴趣的生物型A和B之间的系统发生关 系。
[0084] 因此，在本发明另一个方面，以上限定的组合物特征在于甲硫氨酰-tRNA合成酶 (metG)和柠檬酸合酶I(gltA)基因的DNA序列：
[0085] ⑴在嗜水气单胞菌生物型A细菌中内部比较时相同，以及
[0086] (ii)在嗜水气单胞菌生物型B细菌中内部比较时相同，以及
[0087] (iii)当嗜水气单胞菌生物型A与嗜水气单胞菌生物型B比较时，其显示 gltA95-99. 9%的DNA序列相同性，以及
[0088] (iv)当嗜水气单胞菌生物型A与嗜水气单胞菌生物型B比较时，其显示metG 95-99. 9%的DNA序列相同性，以及
[0089] (V)当嗜水气单胞菌生物型A与嗜水气单胞菌生物型B比较时，其显示95-99. 9% 的DNA序列相同性。
[0090] 对此，在第（iii)点中，gltA95-99. 9%的DNA序列相同性包括：优选96-99%的 gltADNA序列相同性，更优选97-98%的gltADNA序列相同性以及最优选97. 4%的gltA DNA序列相同性。
[0091] 在第（iv)点中，metG95-99. 9%的DNA序列相同性包括：优选95. 5-98%的metG DNA序列相同性，更优选96-97%的metGDNA序列相同性以及最优选96. 2%的metGDNA序 列相同性。
[0092] 在第（V)点中，当gltA和metG进行比较时，95-99. 9%的DNA序列相同性包括：优 选比较时95. 5-98 %的DNA序列相同性，更优选比较时96-97 %的DNA序列相同性以及最优 选比较时96. 8%的DNA序列相同性。
[0093] 作为另一个实施方案，以上限定的组合物为适合腹膜内注射的剂型，例如 0. 01-0. 2ml/剂量的体积，更优选0. 03-0. 15ml/剂量的体积，甚至更优选0. 05-0.Iml/剂量 的体积。
[0094] 在本发明另一个实施方案中，以上限定的组合物的剂量限定为包含多IO7细菌/ ml的量的能够与来自由嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌，和/或 多IO7细菌/ml的量的能够与来自由嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应的 细囷。
[0095] 发明人指出具有来自生物型A的抗原的疫苗防止属于血清群A的嗜水气单胞菌 攻击，但不能防止属于血清群B的嗜水气单胞菌攻击。具有来自生物型B的抗原的疫苗防 止属于血清群B的嗜水气单胞菌攻击，但不能防止属于血清群A的嗜水气单胞菌攻击。如 果疫苗含有来自两种生物型即嗜水气单胞菌生物型A和B的抗原，该疫苗防止来自生物型 A和B的嗜水气单胞菌分离物的攻击。
[0096] 另外已经指出，包含生物型A和生物型B的联合疫苗能够有效提供针对来自例如 东南亚的例如嗜水气单胞菌的临床爆发，诸如越南湄公河三角洲的临床爆发所测试的菌株 的保护。
[0097] 因此，在这方面，以上限定的组合物的另一方面是免疫原性组合物例如疫苗形式。
[0098] 在另一方面，本发明涉及如上限定的细菌或组合物，用于防止或减少鱼中败血病 的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生，所述鱼特别包括鲶形目、鲈形目 和鲤形目的鱼。如果属于鲶形目，所述鱼优选为巨鲶（巴丁鱼）。
[0099] 用途
[0100] 作为第四个主要方面，本发明涉及如上限定的细菌或组合物用于制备防止或减少 鱼中败血病的发生和/或用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生的药物的用途。
[0101] 在本发明的具体实施方案中提供上文所述嗜水气单胞菌生物型A的细菌或来自 所述嗜水气单胞菌生物型A细菌的抗原性和/或免疫原性材料在制备用于制备防止或减少 鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生的组合物中的用途，其 中所述组合物与包含嗜水气单胞菌生物型B细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型B细菌的 抗原性和/或免疫原性材料的组合物共同施用。
[0102] 在相等的特定技术方案中本发明提供上文所述嗜水气单胞菌生物型B细菌或来 自所述嗜水气单胞菌生物型B细菌的抗原性和/或免疫原性材料在制备用于制备防止或减 少鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生的组合物中的用途， 其中所述组合物与包含上文所述嗜水气单胞菌生物型A细菌或来自所述嗜水气单胞菌生 物型A细菌的抗原性和/或免疫原性材料的组合物共同施用。
[0103] 其他实施方案提供了包含上文所述嗜水气单胞菌生物型A细菌和/或来自所述 嗜水气单胞菌生物型A细菌的免疫原性材料的组合物，用于防止或减少鱼中败血病的发生 /用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生，其中所述组合物与包含上文所述嗜水气 单胞菌生物型B细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型B细菌的抗原性和/或免疫原性材料 的组合物共同施用。
[0104] 其他实施方案提供了包含上文所述嗜水气单胞菌生物型B细菌或来自所述嗜水 气单胞菌生物型B细菌的抗原性和/或免疫原性材料的组合物，用于防止或减少鱼中败血 病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生，其中所述组合物与包含上文所 述嗜水气单胞菌生物型A细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型A细菌的抗原性和/或免疫 原性材料的组合物共同施用。
[0105] 在这方面，所述鱼优选是鲶形目、鲈形目和鲤形目。如果属于鲶形目，所述鱼优选 为巨鲶（巴丁鱼）。
[0106] 制备方法
[0107] 作为第五个主要方面，本发明涉及制备如上限定的组合物的方法，包含组合
[0108] ⑴抗原性和/或免疫原性材料，选自免疫