原性含量的嗜水气单胞菌细菌，所述细 菌能与来自由根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布 达佩斯条约"保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼 的抗血清反应，以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料；
[0109] 和
[0110] (ii)抗原性和/或免疫原性材料，选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌，所述 细菌能够与来自由根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏 的布达佩斯条约"保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫 的鱼的抗血清反应，以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
[0111] 实施例部分提供本发明上述方面的试验背景。
[0112] 发明详述
[0113] 用于免疫原性组合物/疫苗的细菌形式
[0114] 本发明的联合疫苗的细菌可以减毒活形式、灭活形式例如菌苗或甚至片段化形式 存在。这一点的重要因素是细菌的免疫原性性能仍然存在。
[0115] 减毒活细菌相对于菌苗的优势在于它们易于给予而无需佐剂。而且它们自复制到 一定程度，直至它们被免疫系统停止，由此能给予较低数量的细胞。另一方面，当细菌以菌 苗形式存在时这些细菌也呈现免疫原性特征，其中菌苗相对于减毒活细菌的优势在于它们 在应用中非常安全。
[0116] 因此，在该实施方案的一个优选形式中，本发明涉及免疫原性组合物或疫苗，其中 嗜水气单胞菌细胞是灭活的。
[0117] 细菌的灭活可以通过化学或物理方式获得。化学灭活可通过用例如但不限于酶、 甲醛（福尔马林）、P_丙内酯或乙烯亚胺或其衍生物、有机溶剂和/或去污剂处理细菌而 进行。物理灭活可有利地通过使细菌接受高能辐射例如UV光、y辐照或X-射线而进行。 这些都是本领域熟知的灭活方式。本发明人的经验是，甲醛（福尔马林）灭活的确是灭活 嗜水气单胞菌生物型A和B的有用方式。因此，在一个优选实施方案中，细菌通过添加甲醛 灭活。
[0118] 与其他抗原组合的嗜水气单胞菌生物型A和B
[0119] 本发明的免疫原性组合物或疫苗还包含将嗜水气单胞菌生物型A和B与其他抗原 组合，例如但不限于鲶鱼爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌、柱状黄杆菌、海豚链球菌、无乳链球 菌、停乳链球菌、副乳房链球菌。
[0120] 药物学可接受的载体-佐剂
[0121] 疫苗是来自特定病原性生物的抗原的各种制备物，其为非病原性的。它们刺激免 疫系统并增加对来自特定病原体后续感染疾病的抗性。疫苗可以是基于水或基于油的。通 常，注射疫苗是基于油的，因为油提供佐剂性质。这是指油增加疫苗的效力以及期望的保护 时间。
[0122] 适用于油包水乳液的本发明的油佐剂是例如矿物油或可代谢油。可代谢油是例如 植物油诸如花生油和大豆油，动物油诸如鱼油角鲨烷和角鲨烯，以及生育酚及其衍生物。
[0123] 本发明的适合的佐剂是例如油包水乳液、水包油乳液和水包油包水双乳液。本领 域已知特别是灭活疫苗，例如菌苗当以油包水乳液给予时显示改善的免疫原性。
[0124] 疫苗或免疫原性组合物经常与稳定剂混合，例如保护易降解蛋白不被降解，例如 增加疫苗的保质期。本发明的有用的稳定剂是碳水化合物例如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀 粉、蔗糖、右旋糖酐或葡萄糖，蛋白诸如白蛋白或酪蛋白或其降解产物，以及缓冲液，诸如碱 金属磷酸盐，均为本领域已知。
[0125]另外，所述疫苗可悬浮于一或多种药物学可接受的载体中。
[0126] 适用于本发明的疫苗的药物学可接受的载体的实例为无菌水、盐水、含水缓冲液 例如PBS等等。
[0127] 本发明的免疫原性组合物或疫苗，尤其是包含菌苗的免疫原性组合物疫苗在优选 方案中也可含有免疫刺激物质。
[0128] 本发明的免疫原性组合物或疫苗还可包含所谓的"载体"。载体是一种化合物， 细菌附着于它，但不与它共价结合。这些载体是生物微囊、微藻酸盐、脂质体和大溶胶 (macrosol，亲水性的物质溶解在疏水性的溶剂中而得到），均为本领域已知。
[0129] 另外，免疫原性组合物或疫苗可包含一或多种适合的表面活性化合物或乳化剂， 均为本领域已知。
[0130] 对适于鱼类和贝类疫苗的佐剂的进一步的阐述可见于JanRaa(1996)的综述文 章，其内容通过引用整体并入本文。有用的无机佐剂是本领域技术人员已知的，并且记载于 JCAguilarandEGRodriguez, 2007,Vaccine25, 3752-3762,其内容通过引用整体并入本 文。
[0131] 施用途径（剂型）
[0132] 可以使用本领域已知的多种施用方式。本发明的免疫原性组合物或疫苗优选通过 注射、浸没、浸渍或经口服施用给鱼。浸没施用和腹膜内注射是尤其吸引人的施用方式。作 为本发明的优选实施方案，菌苗与佐剂经腹膜内注射是非常有效的接种途径。
[0133] 尽管可以包括其他剂型，包括基于鱼饲料的固体剂型或用于浸没的液体形式，但 本发明的剂型优选为液体剂型，更优选为用于注射，例如腹膜内注射的液体剂型。
[0134] 以下所列为本发明疫苗施用的几种不同的途径和方式。
[0135] 口服途径
[0136]口服接种抗原是本领域已知的，其中疫苗与饲料混合，或包被于饲料上（包封， topdressed)或生物包囊化。当抗原要整合入饲料中时，需考虑抗原的热敏感性。当疫苗用 作饲料中的包被（topdressing)时，通常使用包被剂，以防止抗原从片剂中沥滤，或防止抗 原在鱼胃的酸性环境中分解。
[0137] 当需对鱼苗接种时，可使用生物包囊作用。例如，活饲料诸如卤虫无节幼体 (Artemianauplii)、烧足虫或轮虫在疫苗悬液中孵育，之后喂给鱼苗。由于这些活生物是 非选择性滤食动物，它们将在其消化道内积累抗原，由此将其自身转化为活的微胶囊。
[0138] 浸没疫苗
[0139] 皮肤上皮和鳃具有以广谱及特异性方式保护鱼的机制。浸没接种基于粘膜表面识 别其接触的病原体的能力运作。当将鱼浸入含有稀释的疫苗的水中时，来自疫苗的悬浮的 抗原可被皮肤和鳃吸收。然后，存在于皮肤和鳃上皮的特化的细胞例如抗体分泌细胞将被 活化，并当鱼在后期暴露于活的病原体时保护鱼。定位于皮肤和鳃上皮的其他细胞，例如抗 原递呈细胞（巨噬细胞/树突细胞）也吸收疫苗抗原并将其转运至特化的组织，在此建立 系统免疫应答。
[0140] 在浸没接种中，由两种应用方法：浸渍（dip)和浸浴（bath)。在浸渍接种中，将鱼 非常短时（通常为30秒）地浸入高浓度疫苗溶液中，通常1份疫苗产物对9份水。对于浸 浴接种，鱼较长时间（通常一至几个小时）暴露于较低浓度的疫苗。
[0141] 注射接种
[0142] 注射接种需要对鱼轻度麻醉。这减少由于接种的压力，防止机械性损伤并帮助鱼 从处理中更快恢复。
[0143] 注射疫苗可以通过肌内或腹膜内（腹膜腔中）注射施用，但后者是迄今最普遍的 并在本发明中优选。腹膜内注射接种包括将疫苗沉积于腹膜腔中，重要的是针应该穿透鱼 的目标腹壁1_2_。短针可能使疫苗沉积于肌肉系统，并造成炎症和差的免疫应答。
[0144] 作为接种的结果，通常需要两周或更多周（通常约400度日（degreeday))以形 成良好的免疫保护。因此，重要的是在接种后的几周内不要对鱼施压，因为已知压力会抑制 免疫系统。
[0145] 注射疫苗具有许多主要的优势，使其成为优选的接种方法。注射疫苗提供长期的 保护，即优选整个生产周期，并且其允许多种抗原组合在单独施用给予的单一疫苗中。另 外，渔民可以确保群体中的每条鱼均接受疫苗并且剂量正确。
[0146] 疫苗中所用细菌的量/体积
[0147] 应当理解，本发明的疫苗应当含有抗原，其量在将组合物适当施用（例如腹膜注 射）于鱼后，足以引发免疫应答，优选保护性应答。
[0148] 当欲进行腹膜注射时，剂型优选具有0. 01-0. 2ml/鱼的体积，更优选0. 03-0.Iml/ 鱼的体积，甚至更优选〇. 05-0.Iml/鱼的体积。
[0149] 相关基因型和表型特征
[0150] 在其他实施方案中，用于本发明疫苗的细菌是具有与保藏菌株相关或相似的基因 型特征的菌株或分离物。"相关或相似"是指如果根据实施例2进行遗传分型，所述菌株将 落入与保藏菌株相同的种类/组。落入与本发明保藏菌株相同的种类/组定义为与实施例 2的两种基因具有超过99%的核苷酸序列相同性。
[0151] 在其他实施方案中，用于本发明疫苗的细菌是具有与保藏菌株相关或相似的表型 特征的菌株或分离物。"相关或相似"是指表型相似/相关的菌株或分离物将与针对保藏菌 株制备的抗血清反应。
[0152] 本发明的疫苗适用于鱼中，例如鲶形目、鲈形目和鲤形目的鱼中，其包括但不限于 巨鲶属、巨鲶（Pangasionodon)属、鮰属、丽鯛属、罗非鱼属和鲤属。
[0153] 巨鲶
[0154]巨鲶是一类鲶形目鲶鱼，属于巨鲶（Pangasiidae)属D巨鲶（Pangasiidae)是泰 国湄公河和湄南河流域本地的。国际市场最重要的养殖鱼是巴丁鱼。它们在北美和澳大利 亚经常被标记为"巴沙鱼"。在欧洲，这些有通常以"巨鲶（pangasius)"或"巨鲶（panga)" 上市。巨鲶（Pangasiidae)是世界上生长最快的水产养殖类型之一，并且大多数养殖的巨 鲶来自同一个物种，巴丁鱼。还有一小部分是博氏巨鲶（Pangasiusbocourtih越南是巨 鲶种的主要生产者。
[0155] 巨鲶（Pangasianodon)属中的种类包括但不限于巴丁鱼和湄公河巨鲶 (Pangasianodongigas)D巨鲶属包括但不限于：博氏巨鲶（Pangasiusbocourti)、 贝It(Pangasiusconchophilus)、贾巴It(Pangasiusdjambal)、长巨It (Pangasiuselongatus)、大肩巨It(Pangasiushumeralis)、马来亚巨It(Pangasius kinabatanganensis)、克氏巨It(Pangasiuskrempfi)、姜黄巨It(Pangasiuskunyit)、拉 氏巨It(PangasiusIarnaudii)、石口巨It(PangasiusIithostoma)、大线巨It(Pangasius macronema)、马哈卡门西斯巨舱（Pangasiusmahakamensis)、湄公巨舱（Pangasius mekongensis)、鼠眼巨It(PangasiusMyanmar)、细尾巨It(Pangasiusnasutus)、尼氏 巨It(Pangasiusnieuwenhuisii)、巨It(Pangasiuspangasius)、多齿巨It(Pangasius polyuranodon)、李奥菲勒斯巨It(PangasiusrheophiIus)、沙巴巨It(Pangasius sabahensis)和长丝巨It(Pangasiussanitwongsei) 〇
[0156] 河舱（Ictaluruspunctatis)
[0157] 河鲶也是鲶形目的一种。本发明的疫苗还涉及河鲶，其为北美最多的鲶鱼种类，因 为过去十年该种类在美国水产养殖的快速增长。河鲶还产于例如中国等其他国家。
[0158] 罗非鱼类群
[0159] 罗非鱼群（tribeTilapiini)属于自卢形目丽鱼科（Cichlids)该群包括口孵非鲫 属、帚齿非鲫属和罗非鱼属。罗非鱼类群是在渔业养殖中商业化最重要的鱼类之一，这缘于 它们的尺寸、快速生长、其食草动物本性和适口性。
[0160] 罗非鱼是渔业养殖努力的焦点，例如在中国（世界上最大的罗非鱼生产者），随后 是埃及、印度尼西亚、菲律宾、泰国、巴西、越南和台湾。
[0161] 罗非鱼群（tribeTilapiini)的种类包括但不限于尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus)、奥利亚口 孵非鲫（Oreochromisaureus)、亨氏口 孵非鲫（Oreochromis hunteri)、红腹非鲫（Tilapiabakossiorum)、巴劳氏非鲫（Tilapiabaloni)、比氏非鲫 (Tilapiabemini)、双线与g軎即（Tilapiabilineata)、短手与g軎即（Tilapiabrevimanus)、 巴苏非鲫（Tilapiabusumana)、布氏非鲫（Tilapiabuttikoferi)、深非鲫（Tilapia bythobates)、卡布拉非鲫（Tilapiacabrae)、金马伦非鲫（Tilapiacameronensis)、喀 麦隆非鲫（Tilapiacamerunensis)、塞西非鲫（Tilapiacessiana)、科菲非鲫（Tilapia coffea)、康杰非鲫（Tilapiacongica)、达氏非鲫（Tilapiadageti)、德氏非鲫（Tilapia deckerti)、杂色非鲫（Tilapiadiscolor)、黄非鲫（Tilapiaflava)、吉纳非鲫（Tilapia guinasana)(OtjikotoTilapia)、几内亚与g軎即（Tilapiaguineensis)(Guineantilapia)、 大咽非鲫（Tilapiagutturosa)、瓦鱗非鲫（Tilapiaimbriferna)、喜暖非鲫（Tilapia ismailiaensis)、贾氏非鲫（Tilapiajallae)、乔克非鲫（Tilapiajoka)、科特非鲫 (Tilapiakottae)、卢卡非鲫（TilapiaIouka)、珍珠非鲫（Tilapiamargaritacea)、点 与g軎即（Tilapiamariae)(Blackmangrovecichlid)、尼翁与g軎即（Tilapianyongana)、 伦氏非鲫（Tilapiarendalli)(Bluetilapia)、溪非鲫（Tilapiarheophila)、鲁氏非 鲫（Tilapiaruweti)(Okavangotilapia)、施氏非鲫（Tilapiasnyderae)、斯氏非鲫 (Tilapiasparrmanii)(Bandedbream)、绵与g軎即（Tilapiaspongotroktis)、索氏与g軎即 (Tilapiatholloni)/赛氏非鲫（Tilapiathysi)、沃氏非鲫（Tilapiawalteri)、齐氏非鲫 (Tilapiazillii)(Cichlid)〇
[0162] 鲤鱼
[0163] 鲤鱼是鲤形目和鲤科的各种淡水鱼，这是欧洲和亚洲本地的非常大的类群的鱼。 趣鱼的种类包括但不限于：鲢鱼（Hypophthalmichthysmolitrix)(silvercarp)、趣鱼 (Cyprinuscarpio)(commoncarp)、草趣鱼（Ctenopharyngodonidella)(grasscarp)、缠 鱼（Hypophthalmichthysnobilis)(bigheadcarp)、黑軎即（Carassiuscarassius)(Cruian carp)、卡特拉魚比（Cyprinuscatla)(Catlacarp)、卷须M(Ciirhinuscirrhosus)(Mrigal carp)、青鱼（Mylopharyngodonpiceus)(Blackcarp)、鏡鱼（Cirrhinusmolitorella) (Mudcarp)和南亚野鏡（Labeorohita) (Roho).
[0164] 定义
[0165] 嗜水气单胞菌
[0166] 嗜水气单胞菌是革兰氏阴性杆状细菌，0. 3-1微米宽，1-3微米长。嗜水气单胞菌 通常被认为是鱼中的无毒或二级病原体，并且主要见于温暖气候地区。该细菌可见于淡水 或微咸水中，并且经常对最常见抗生素具有抗性。嗜水气单胞菌已知在许多种鱼中造成疾 病，例如罗非鱼（尼罗口孵非鲫）、舱鱼（Clariasbatrachus，Ichtaluruspunctatus)、金鱼 (Crassiusauratus)、普通趣鱼（Cyprinuscarpio)、鑛鱼（欧洲鑛鲡）和虹蹲鱼（虹蹲） (Santosetal1988,PridgeonandKlesius2011,