通过用嗜水气单胞菌生物型A、嗜水气单胞菌生物型B 或鲶鱼爱德华氏菌进行攻击，测量疫苗的保护效果。产生相对生存百分比（RPS)多60的 疫苗被认为是保护性的。（+=保护性疫苗，相对生存百分比（RPS)多60)。
[0335] 实施例7:罗非鱼（尼罗罗非鱼）中的嗜水气单胞菌接种和攻击
[0336] 在可控的实验室试验中测试含有嗜水气单胞菌生物型A、嗜水气单胞菌生物型B 以及鲶鱼爱德华氏菌的疫苗在罗非鱼（尼罗罗非鱼）中的效力，其中接种和未接种（对照） 的鱼接受实验性攻击。120条罗非鱼接种含有嗜水气单胞菌生物型A、嗜水气单胞菌生物型 B以及鲶鱼爱德华氏菌的0. 05ml的多价（油包水乳液）疫苗。抗原浓度彡IO7细菌/ml。 接种和对照鱼（120条罗非鱼）经标记并于28°C共同保持在相同的水槽中。
[0337] 接种3周后，将30条来自接种组的鱼和30条来自未接种对照组的鱼转移至攻击 水槽，并以两种不同的攻击剂量在重复水槽中使用嗜水气单胞菌生物型A进行攻击（水槽 1-4)。每天计数死鱼，攻击持续直至两天内任意组中不再发生死亡。使用以下公式计数相 对生存％ (RPS):
[0338] RPS = [1_(接种组死鱼％ /对照组死鱼％)]*100
[0339]
[0340] 结论：嗜水气单胞菌生物型A在罗非鱼中具有毒性。含有嗜水气单胞菌生物型A 的多价疫苗引发针对嗜水气单胞菌生物型A攻击的保护。
[0341] 实施例8.在不同种鱼类中的嗜水气单胞菌接种和攻击
[0342] 制备含有嗜水气单胞菌抗原的疫苗并通过腹膜内注射进行鱼接种。所用的鱼类是 由普通鲤鱼（Cyprinuscarpio)代表的鲤鱼和南亚野鲮（Labeorohita)、由尼罗罗非鱼代 表的罗非鱼和澳洲肺鱼（Latexcalcarifer)。接种2-4周后，用至少一种嗜水气单胞菌毒 性菌株对鱼进行攻击，未接种对照组中的死亡率与接种鱼中的死亡率进行比较。计算相对 生存百分比，具有RPS多60的疫苗被认为有效。
[0343] 微生物保藏的收据
[0344] 以下菌株已根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保 藏的布达佩斯条约"进行保藏。
[0345] 发明人于2012年8月29日将以下细菌菌株保藏于保藏机构"英国SP40JG威尔 特郡索尔兹伯里市波顿镇的健康保护局培养物中心（HealthProtectionAgencyCulture Collections,PortonDown,Salisbury,Wiltshire,SP40JG,UK) "，保藏号如下：
[0346] 嗜水气单胞菌，生物型A(AL20133)保藏号12082901
[0347] 嗜水气单胞菌，生物型B(AL20215)保藏号12082902
[0348] 参考文献
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[0361] 序列表
【主权项】
1. 分离的嗜水气单胞菌生物型A细菌，所述菌株选自以下组： (i) 根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯 条约"保藏于英国SP4 OJG威尔特郡索尔兹伯里市波顿镇的健康保护局培养物中心（Health Protection Agency Culture Collections,Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 〇JG，UK)的保藏号为12082901的细菌； (ii) 能够与来自用i)中限定的细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。2. 根据权利要求1的细菌，其中，所述细菌具有与权利要求1中限定的保藏的细菌相关 的基因型和/或表型特征。3. 根据权利要求1或2的细菌，其中，所述表型特征包括当在重10-20g的鱼中经腹膜 内注射100_2000cfu/鱼的量以及0.1 ml的注射体积时，在巨鲶（巴丁鱼）中诱导败血病， 并且任选地，诱导死亡的临床症状的能力。4. 根据之前权利要求任意项的细菌，其中，所述表型特征包括在重10_20g的鱼中经腹 膜内注射100_2000cfu/鱼的量以及0.1 ml注射体积的所述细菌后的2-5天内，在巨鲶（巴 丁鱼）中诱导败血病，并且任选地，诱导至少50%死亡的临床症状的能力。5. 根据之前权利要求任意项的细菌，其中，所述基因型特征包含甲硫氨酰-tRNA合成 酶（metG)基因，该基因包含与SEQ ID NO: 1所示序列至少99%相同的序列，和/或柠檬酸 合酶I (gltA)基因，该基因包含与SEQ ID NO: 2所示序列至少99%相同的序列。6. 根据之前权利要求任意项的细菌，其中，与来自用所述保藏的细菌免疫的鱼的抗血 清反应的所述能力由本文所述的玻片凝集试验确定。7. 分离的嗜水气单胞菌生物型B细菌，所述菌株选自以下组： (i) 根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯 条约"保藏于英国SP4 OJG威尔特郡索尔兹伯里市波顿镇的健康保护局培养物中心（Health Protection Agency Culture Collections, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 〇JG，UK)的保藏号为12082902的细菌； (ii) 能够与来自用i)中限定的细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。8. 根据权利要求7的细菌，所述细菌具有与权利要求7中限定的保藏的细菌相关的基 因型和/或表型特征。9. 根据权利要求7或8的细菌，其中，所述表型特征包括当在重10-20g的鱼中经腹膜 内注射100_6000cfu/鱼的量以及0.1 ml的注射体积时，在巨鲶（巴丁鱼）中诱导败血病， 并且任选地，诱导死亡的临床症状的能力。10. 根据权利要求7-9任意项的细菌，其中，所述表型特征包括在重10-20g的鱼中经腹 膜内注射100_6000cfu/鱼的量以及0.1 ml注射体积的所述细菌后的2-5天内，在巨鲶（巴 丁鱼）中诱导败血病，并且任选地，诱导至少50%死亡的临床症状的能力。11. 根据权利要求7-10任意项的细菌，其中，所述基因型特征包含甲硫氨酰-tRNA合成 酶（metG)基因，该基因包含与SEQ ID N0:3所示序列至少99%相同的序列，和/或柠檬酸 合酶I (gltA)基因，该基因包含与SEQ ID NO: 4所示序列至少99%相同的序列。12. 根据权利要求7-11任意项的细菌，其中与来自用所述保藏的细菌免疫的鱼的抗血 清反应的所述能力由本文所述的玻片凝集试验确定。13. -种组合物，其包含免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌，所述细菌能够与来自由根 据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约"保 藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌或其来源的抗原性和/ 或免疫原性材料免疫的鱼的抗血清反应；或包含来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材 料。14. 一种组合物，其包含免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌，所述细菌能够与来自由根 据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约"保藏 的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应；或 包含来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。15. -种组合物，包含： (i) 抗原性和/或免疫原性材料，选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌，所述细菌能 与来自由根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩 斯条约"保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗 血清反应，以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料； 和 (ii) 抗原性和/或免疫原性材料，选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌，所述细菌 能够与来自由根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布 达佩斯条约"保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼 的抗血清反应，以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。16. 根据权利要求13-15任意项的组合物，其中，能够与来自由嗜水气单胞菌生物型A 免疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌细菌如权利要求1-7任意项限定。17. 根据权利要求13-16任意项的组合物，其中，能够与来自由嗜水气单胞菌生物型B 免疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌细菌如权利要求8-12任意项限定。18. 根据权利要求13-17任意项的组合物，特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞 菌细菌是减毒活的形式。19. 根据权利要求13-18任意项的组合物，特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞 菌细菌是灭活的形式。20. 根据权利要求13-19任意项的组合物，特征在于免疫原性含量的嗜水气单胞菌细 菌是杀死的形式。21. 根据权利要求13-20任意项的组合物，特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞 菌细菌以减毒活的、灭活的和杀死形式的混合物存在。22. 根据权利要求13-21任意项的组合物，特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞 菌细菌与一或多种其他抗原组合，例如来自细菌鲶鱼爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌、柱状黄 杆菌、海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、副乳房链球菌的抗原。23. 根据权利要求13-22任意项的组合物，特征在于嗜水气单胞菌细菌以多10 7细菌/ ml的量存在。24. 根据权利要求13-23任意项的组合物，特征在于能够与来自由嗜水气单胞菌生物 型A细菌免疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌细菌以多IO 7细菌/ml的量存在。25. 根据权利要求13-24任意项的组合物，特征在于能够与来自由嗜水气单胞菌生物 型B细菌免疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌以多IO 7细菌/ml的量存在。26. 根据权利要求13-25任意项的组合物，其中甲硫氨酰-tRNA合成酶（metG)和柠檬 酸合酶I (gltA)基因的DNA序列： (i) 在嗜水气单胞菌生物型A细菌中内部比较时相同，以及 (ii) 在嗜水气单胞菌生物型B细菌中内部比较时相同，以及 (iii) 当嗜水气单胞菌生物型A与嗜水气单胞菌生物型B比较时，其显示 gltA95-99. 9%的DNA序列相同性，以及 (iv) 当嗜水气单胞菌生物型A与嗜水气单胞菌生物型B比较时，其显示metG 95-99. 9%的DNA序列相同性，以及 (V)当嗜水气单胞菌生物型A与嗜水气单胞菌生物型B比较时，其显示95-99. 9%的 DNA序列相同性。27. 根据权利要求13-26任意项的组合物，特征在于组合物为适合腹膜内注射的剂型。28. 根据权利要求27的组合物，特征在于剂型优选具有0. 01-0. 2ml/剂量的体积。29. 根据权利要求28的组合物，其中，每个剂量包含以多10 7细菌/ml的量存在的能够 与来自由嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌，和/或以多IO 7细菌/ ml的量存在的能够与来自由嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。30. 根据权利要求13-29任意项的组合物，特征在于其为免疫原性组合物。31. 根据权利要求13-30任意项的组合物，特征在于其为疫苗形式。32. 根据权利要求1-12任意项的细菌或根据权利要求13-31任意项的组合物，用于防 止或减少鱼中败血病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生。33. 根据权利要求32的细菌或组合物，特征在于所述鱼是鲶形目、鲈形目和鲤形目的 鱼。34. 根据权利要求33的细菌或组合物，其中，所述鱼是巨鲶（巴丁鱼）。35. -种组合物，包含根据权利要求1-6任意项的嗜水气单胞菌生物型A细菌或来自所 述嗜水气单胞菌生物型A细菌的抗原性和/或免疫原性材料，用于防止或减少鱼中败血病 的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生，其中，所述组合物与包含根据权 利要求7-12任意项的嗜水气单胞菌生物型B细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型B细菌 的抗原性和/或免疫原性材料的组合物共同施用。36. -种组合物，包含根据权利要求7-12任意项的嗜水气单胞菌生物型B细菌或来自 所述嗜水气单胞菌生物型B细菌的抗原性和/或免疫原性材料，用于防止或减少鱼中败血 病的发生/用于防止或减少鱼中嗜水气单胞菌感染的发生，其中，所述组合物与包含根据 权利要求1-6任意项的嗜水气单胞菌生物型A细菌或来自所述嗜水气单胞菌生物型A细菌 的抗原性和/或免疫原性材料的组合物共同施用。37. 制备权利要求13-31任意项限定的组合物的方法，包含组合 (i) 抗原性和/或免疫原性材料，选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌，所述细菌能 够与来自由根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达 佩斯条约"保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼的 抗血清反应，以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料； 和 (ii) 抗原性和/或免疫原性材料，选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌，所述细菌 能够与来自由根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布 达佩斯条约"保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼 的抗血清反应，以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种组合物，例如免疫原性组合物或疫苗形式，用于保护鱼免受嗜水气单胞菌的感染。本发明还涉及免疫原性含量的两种高毒性嗜水气单胞菌菌株(一种属于生物型A，一种属于生物型B)例如在免疫原性组合物或疫苗中的组合，以提供对嗜水气单胞菌造成的感染的有效的预防性保护。NCTC 1208290120120829
【IPC分类】A61K39/02, C12N1/20, C12R1/01, A61P31/04
【公开号】CN105121625
【申请号】CN201380062909
【发明人】董武阮, 陈凤庆, 黎氏芳金, 张庭阮福, 安雅尼·加德, 丽芙·布鲁姆·亨格霍尔德, 列夫·阿瑞·克雷凡
【申请人】法玛克公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2013年10月24日
【公告号】EP2912198A1, WO2014064217A1