Esteveetal1994)〇
[0167] 分离
[0168] 当与本发明的细菌相关使用时，术语"分离"指从其天然环境，例如来自其鱼宿主 的细胞和组织中脱离时的细菌。特别的，术语"分离"指培养物，例如来自感染宿主的组织 样品的细菌纯培养物。
[0169] 联合疫苗/多价疫苗
[0170] 联合疫苗/多价疫苗定义为一种疫苗，其由组合成单一产物的两种或更多种单独 的免疫原组成。
[0171] 尽管单价疫苗设计为针对单一抗原或单一微生物免疫，多价联合疫苗能够提供针 对多种不同疾病的免疫。与多价疫苗相比，单价疫苗通常提供针对相关抗原的增加的免疫。 这可以解释为在多价疫苗中，当其在接种的鱼中产生免疫应答时，不同生物型之间会发生 干扰，而在单价疫苗中则不会发生该干扰。
[0172] 临床爆发
[0173] 临床爆发是流行病学研究术语，用于流行病学以描述在特定时间和地点疾病的发 生高于预期。
[0174] 运动型气单胞菌属败血症（败血病）
[0175] 败血症（又名败血病）是指在血流中存在病原性生物，导致败血病。
[0176] 由嗜水气单胞菌造成的败血病或运动型气单胞菌属败血症是越南巨鲶养殖中最 常见的疾病之一。在湄公河三角洲，运动型气单胞菌属败血症可整年发作，因季节由湿变干 或诸如处理、运输、高水平的亚硝酸盐、氨等的应激物尤其会造成显著损失。运动型气单胞 菌属败血症的临床症状是来自细菌的溶血素造成的出血。
[0177] 大多数被感染鱼所观察到的外部迹象是大头、突眼症、鱼表面红化、肛门和鳍出 血。溃疡性皮肤病变也常见于被感染的鱼，伴随鳍或尾坏死（腐鳍病）。
[0178] 在内部，临床积水中会有过量清澈或微红液体，但大多数情况下，主要特征是具有 亮红色的内脏充血。脾可视化增大、变圆且显示樱桃红。增大的肾脏经历了液化性坏死，并 且当其被切开时，坏死性液体渗出。
[0179] 发明人证实嗜水气单胞菌是对巨鲶鱼非常高毒性的病原体。在一个实验中， 100-2000cfu生物型A/鱼的攻击剂量和100-6000cfu生物型B/鱼的攻击剂量在2天内造 成60-100%的鱼死亡率。观察到运动型气单胞菌属败血症的临床病症，并从死鱼中重新分 离出嗜水气单胞菌。
[0180] 在本领域中，当涉及嗜水气单胞菌时，温度的突然变化或对鱼的处理或转移会导 致损失。运动型气单胞菌属败血症会在整个养殖周期中造成损失，在特定水塘中会反复爆 发。在爆发期内，养殖的鱼会被其他病原体感染，给渔民造成严重损失。
[0181] 生物型
[0182] 用于例如本发明的组合物或疫苗的细菌是具有与保藏菌株相关或相似的基因型 特征的菌株或分离物。"相关或相似"是指如果根据实施例2对基因型相似/相关的菌株或 分离物进行遗传分型，它们将落入与保藏菌株相同的组，即与SEQIDNo. 1和2(生物型A) 或SEQIDNo. 3和4(生物型B)具有至少99%的相同性。
[0183] 另外，用于例如本发明的组合物或疫苗的细菌是具有与保藏菌株相关或相似的表 型特征的菌株或分离物。"相关或相似"是指例如表型相似/相关的菌株或分离物将与针对 保藏菌株制备的抗血清反应。
[0184] 免疫原性含量
[0185] 嗜水气单胞菌细胞的免疫原性含量是诱导免疫应答所必需的抗原的含量，与未接 种的鱼相比，所述免疫应答至少能够降低疾病的严重性和/或感染发生率。
[0186] 序列相同性
[0187] 在本发明的上下文中，术语"序列相同性"是指两个核苷酸序列之间的同源性程度 的定量测量。如果进行比较的两个序列不等长，它们必须进行比对以产生最好的可能的匹
中Ndlf是比对时两个序列中不相同残基的总数，并且其中Nraf是一个序列中的残基数。因 此，0嫩序列六6!^6!'(：将与序列4411^1'(：具有75%的序列相同性怳1￡=241^=8)。缺 口被计算为特定残基的非相同性，即DNA序列AGTGTC将与DNA序列AGTCAGTC具有75%的 序列相同性（Ndif= 2,Nraf= 8)。
[0188] 对于所有与核苷酸序列相关的本发明的实施方案，一或多个序列之间的序列相 同性百分比也可基于使用clustalW软件（http: /www.ebi.ac.uk/clustalW/index.html) 以默认设置进行的比对。对于核苷酸序列比对，这些设置是：比对=3Dfull，GapOpen 10. 00,GapExt. 0? 20,GapseparationDist. 4,DNA权重矩阵：相同性（IUB)。对于氨基酸 序列比对，这些设置是：比对=3Dfull,GapOpen10. 00，GapExt. 0.20，Gapseparation Dist. 4，蛋白质权重矩阵：Gonnet0
[0189] 可选地，核苷酸序列可以使用程序DNASISMax进行分析，序列比较可在http:// www.paralign.org/进行。该服务基于两种名为Smith-Waterman(SW)和ParAlign的比较 算法。第一种算法由Smith和Waterman(1981)公开并且是一种成熟的方法，其发现两个序 列的最优局部比对。另一种算法ParAlign是序列比对的启发方法，关于该方法的细节公开 于Rognes(2001)。可以使用得分矩阵和空位罚分以及E-值的默认设置。
[0190] 基因型特征
[0191] 术语"基因型特征"广义上是指个体基因或基因组的一或多个部分的组成，并总是 反应在个体DNA序列中。
[0192] 表型特征
[0193] 术语"表型特征"在本申请中是指生物的一或多个可观察的性能，其由个体的遗传 基因型和/或非遗传环境变异（例如转录变异、移动DNA和质粒、基因组重排等）的相互作 用产生。在本发明的上下文中，术语"相关表型特征"包括任意以下特征：大小、形状。"表 型特征"还包括在鱼中诱导任意嗜水气单胞菌的临床症状，包括本申请中所述的严重病理 征象的能力。"表型特征"还包括细菌显示与保藏菌种相同的抗原的能力，即与针对保藏菌 种制备的抗血清反应。
[0194] 药物学可接受的载体
[0195] 药物学可接受的载体可以是水或缓冲液，或乳剂例如水包油或油包水乳剂。
[0196] 油包水乳剂
[0197] 包含水和油的乳剂通常是指油包水乳剂、水包油或水包油包水乳剂。乳剂究竟变 成油包水乳剂或水包油乳剂取决于两相的体积分数和乳化剂类型。通常，乳化剂稳定乳剂。
[0198] 病理学
[0199] 嗜水气单胞菌对许多生物具有毒性，并且在进入宿主体内后，其穿过血流到达第 一可用器官。嗜水气单胞菌被认为是机会性病原体，指其很少感染健康个体。嗜水气单胞 菌被广泛认为是鱼病原体。当感染嗜水气单胞菌时，鱼可以出现疡、烂尾病、腐鳍病和出血 性败血症。出血性败血症造成病变，其导致鳞片脱落、鳃及肛区出血、溃疡、突眼症和腹部水 肿 。
[0200] 种系发生
[0201] 种系发生涉及生物之间的进化关系。这通常通过分析感兴趣的生物中的一或几 个保守基因（通常是进化缓慢的管家基因）的DNA(或翻译蛋白）序列而进行。该基因必 须在经分析的所有生物中均存在。用于该目的的最"著名"的基因是16SrRNA基因，其在 所有细菌之间高度保守。然而，由于其非常高水平的保守性，其通常不适于在相同种内比较 不同的菌株。因此，其他保守性较低的管家基因用于区分相似的细菌菌株。并且通过同时 组合几种管家基因的进化，种系发生预测变得更强力。多位点序列分型（MLST)，又名多位点 序列分析（MLSA)通过将来自例如5-9种基因的序列信息组合实现此目的。种系发生关系 通常以种系发生树代表，其使用生物DNA序列作为输入由复杂算法产生。
[0202] 多位点序列分型（MLST)
[0203]MLST是分子生物学中用于多位点分型的技术。其过程能够使用多种管家基因（即 组成型基因，以相对恒定的水平转录）的内部片段的DNA序列表征微生物种的分离物。该 表征基于这些管家基因的序列差异。
[0204] 玻片凝集试验
[0205] 凝集反应是例如含抗原的微生物的悬液中在特异性抗体存在时的凝块。
[0206] 玻片凝集试验是一种试验，其中一定含量的浓缩抗原和例如鱼血清在玻片上混合 以反应特定时间，之后确定凝集反应的存在。
[0207] 相对生存百分比（RPS)
[0208]RPS代表鱼的百分比，若不针对给定疾病进行防护，该鱼会因此死亡，即由于接种 而存活的鱼的比例。经济上可接受的成功接种应当超过60%的RPS值，这意味着在疾病爆 发的情况下，未针对该特定疾病接种的鱼会比接种的鱼蒙受至少三倍的死亡损失。
[0209] RPS=[1_(接种组死鱼％ /对照组死鱼％ )]*100
[0210] 应当注意，本发明诸多方面之一中描述的实施方案和特征也可用于本发明的其他 方面。
[0211] 本发明中引用的所有专利和非专利参考文献通过引用整体并入本文。
[0212] 项目
[0213]1.分离的嗜水气单胞菌生物型A细菌，所述菌株选自以下组：
[0214] ⑴根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布 达佩斯条约"保藏于英国SP40JG威尔特郡索尔兹伯里市波顿镇的健康保护局培养物中心 (HealthProtectionAgencyCultureCollections,PortonDown,Salisbury,Wiltshire, SP40JG，UK)的保藏号为12082901的细菌；
[0215](ii)能够与来自用i)中限定的细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。
[0216]2.根据项目1的细菌，所述细菌具有与项目1中限定的保藏的细菌相关的基因型 和/或表型特征。
[0217] 3.根据项目1或2的细菌，其中所述表型特征包括当在重10_20g的鱼中经腹膜内 注射100-2000cfu/鱼的量以及0.Iml的注射体积时，在巨鲶（巴丁鱼）中诱导败血病，并 且任选地，诱导死亡的临床症状的能力。
[0218] 4.根据之前项目任意项的细菌，其中所述表型特征包括在重10_20g的鱼中经腹 膜内注射100_2000cfu/鱼的量以及0.Iml注射体积的所述细菌后的2-5天内，在巨鲶（巴 丁鱼）中诱导败血病，并且任选地，诱导至少50%死亡的临床症状的能力。
[0219] 5.根据之前项目任意项的细菌，其中所述基因型特征包含甲硫氨酰-tRNA合成酶 (metG)基因，该基因包含与SEQIDNO: 1所示序列至少99%相同的序列，和/或柠檬酸合 酶（gltA)基因，该基因包含与SEQIDN0:2所示序列至少99%相同的序列。
[0220]6.根据之前项目任意项的细菌，其中与来自用所述保藏的细菌免疫的鱼的抗血清 反应的能力由本文所述的玻片凝集试验确定。
[0221] 7.分离的嗜水气单胞菌生物型B细菌，所述菌株选自以下组：
[0222] ⑴根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布 达佩斯条约"保藏于英国SP40JG威尔特郡索尔兹伯里市波顿镇的健康保护局培养物中心 (HealthProtectionAgencyCultureCollections,PortonDown,Salisbury,Wiltshire, SP40JG，UK)的保藏号为12082902的细菌；
[0223] (ii)能够与来自用i)中限定的细菌免疫的鱼的抗血清反应的细菌。
[0224] 8.根据项目7的细菌，所述细菌具有与项目7中限定的保藏的细菌相关的基因型 和/或表型特征。
[0225] 9.根据项目7或8的细菌，其中所述表型特征包括当在重10_20g的鱼中经腹膜内 注射100-6000cfu/鱼的量以及0.Iml的注射体积时，在巨鲶（巴丁鱼）中诱导败血病，并 且任选地，诱导死亡的临床症状的能力。
[0226] 10.根据项目7-9任意项的细菌，其中所述表型特征包括在重10_20g的鱼中经腹 膜内注射100_6000cfu/鱼的量以及0.Iml注射体积的所述细菌后的2-5天内，在巨鲶（巴 丁鱼）中诱导败血病，并且任选地，诱导至少50%死亡的临床症状的能力。
[0227] 11.根据项目7-10任意项的细菌，其中所述基因型特征包含甲硫氨酰-tRNA合成 酶（metG)基因，该基因包含与SEQIDN0:3所示序列至少99%相同的序列，和/或柠檬酸 合酶（gltA)基因，该基因包含与SEQIDN0:4所示序列至少99%相同的序列。
[0228] 12.根据项目7-11任意项的细菌，其中与来自用所述保藏的细菌免疫的鱼的抗血 清反应的能力由本文所述的玻片凝集试验确定。
[0229] 13. -种组合物，其包含免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌，所述细菌能够与来自 由根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约" 保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌或其来源的抗原性和 /或免疫原性材料免疫的鱼的抗血清反应；或包含来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性 材料。
[0230] 14. 一种组合物，其包含免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌，所述细菌能够与来自 由根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约" 保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫的鱼的抗血清反 应；或包含来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
[0231] 15. -种组合物，包含：
[0232] (i)抗原性和/或免疫原性材料，选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌，所述细 菌能与来自由根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布 达佩斯条约"保藏的保藏号为12082901的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型A细菌免疫的鱼 的抗血清反应，以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料；
[0233]和
[0234] (ii)抗原性和/或免疫原性材料，选自免疫原性含量的嗜水气单胞菌细菌，所述 细菌能够与来自由根据"1977年4月28日的国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏 的布达佩斯条约"保藏的保藏号为12082902的细菌代表的嗜水气单胞菌生物型B细菌免疫 的鱼的抗血清反应，以及来自所述细菌的抗原性和/或免疫原性材料。
[0235] 16.根据项目13-15任意项的组合物，其中能够与来自由嗜水气单胞菌生物型A免 疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌细菌如项目1-7任意项限定。
[0236] 17.根据项目13-16任意项的组合物，其中能够与来自由嗜水气单胞菌生物型B免 疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌细菌如项目8-12任意项限定。
[0237] 18.根据项目13-17任意项的组合物，特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞 菌细菌是减毒活的形式。
[0238] 19.根据项目13-18任意项的组合物，特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞 菌细菌是灭活的形式。
[0239] 20.根据项目13-19任意项的组合物，特征在于免疫原性含量的嗜水气单胞菌细 菌是杀死的形式。
[0240] 21.根据项目13-20任意项的组合物，特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞 菌细菌以减毒活的、灭活的和杀死形式的混合物存在。
[0241] 22.根据项目13-21任意项的组合物，特征在于免疫原性含量的所述嗜水气单胞 菌细菌与一或多种其他抗原组合，例如来自细菌鲶鱼爱德华氏菌、迟钝爱德华氏菌、柱状黄 杆菌、海豚链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、副乳房链球菌的抗原。
[0242] 23.根据项目13-22任意项的组合物，特征在于嗜水气单胞菌细菌以彡IO7细菌/ ml的量存在。
[0243] 24.根据项目13-23任意项的组合物，特征在于能够与来自由嗜水气单胞菌生物 型A细菌免疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌细菌以多IO7细菌/ml的量存在。
[0244] 25.根据项目13-24任意项的组合物，特征在于能够与来自由嗜水气单胞菌生物 型B细菌免疫的鱼的抗血清反应的所述嗜水气单胞菌以多IO7细菌/ml的量存在。
[0245]