[0060] 白蛋白结合部分可以是或可包括脂肪酸或脂肪二酸或其衍生物或其任一种。
[0061] 术语"脂肪酸"是指具有4-28个碳原子、例如16个碳原子的脂族一羧酸。其优选 是无支链的，和/或偶数个的，并且它可以是饱和或不饱和的。
[0062] 术语"脂肪二酸"是指如上定义的、但在co位置上具有额外羧酸基团的脂肪酸。因 此，脂肪二酸是二羧酸。
[0063]命名按照本领域常用的命名，例如-C00H以及H00C-，是指駿基；-C6H4-是亚苯 基；-C0-以及-0C-，是指幾基（0=C〈）；和C6H5-〇_是指苯氧基。
[0064]在一个优选的实施方案中，所述接头部分，如果存在的话，具有2-80个C原子、优 选5-70个C原子。在额外优选的实施方案中，所述接头部分，如果存在的话，具有4-20个 杂原子，优选2-40个杂原子，更优选3-30个杂原子。杂原子的特别优选的实例是N原子和 0原子。H原子不是杂原子。
[0065]在另一个实施方案中，所述接头包含至少一个0EG分子、和/或至少一个谷氨酸残 基，或相应的基团（(^是指8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，即以下基团：-順-(〇12)2-0-(〇1 2)2-o-ch2-co-) 〇
[0066] 在一个优选的实施方案中，所述接头部分包含通过酰胺键与唾液酸残基连接的二 羧基残基。在优选的实例中，所述二羧基残基具有2-30个C原子，优选4-20个C原子，更 优选4-10个C原子。在另外的优选实例中，所述二羧基残基具有0-10个杂原子，优选0-5 个杂原子。
[0067]在另一个优选的实例中，所述接头部分包含同时含有氨基和远端羧基的基团，所 述基团通过其远端羧基经由酰胺键与唾液酸残基连接。在一个优选的实施方案中，该基团 是0EG基团。
[0068]氨基酸谷氨酸（Glu)包含2个羧酸基团。其y-羧基优选用于与唾液酸残基或唾 液酸衍生物的氨基、或与0EG分子的氨基（如果有的话）、或与另一 Glu残基的氨基（如果 有的话）形成酰胺键。Glu的氨基进而与延长部分的羧基、或与0EG分子的羧基（如果有的 话）、或与另一 Glu的Y-羧基（如果有的话）形成酰胺键。这种包含Glu的方式偶尔简称 为 " y -Glu"。
[0069]不受理论的束缚，设想之所以将疏水性侧基与具有降低的vWF结合能力的因子 VIII分子连接，而不是将这类侧基与具有正常vWF结合能力的因子VIII分子连接可能有利 的原因在于：侧基的相对大小在大的因子VII I/vWF复合物中是相对小的。假定相对大的侧 基在保护游离因子VIII不被清除中起更有效的作用。还假定FVIII的半衰期与vWF的相 关。与vWF结合能力降低的FVIII分子最有可能具有暴露的清除表位，所述清除表位通常 已被vWF保护。因而假定通过连接侧基，该"清除保护"可被恢复。在其它情况下，侧基例 如抗体片段的连接可通过例如将所述分子与具有相对长循环半衰期的蛋白、细胞或血小板 连接而起作用。
[0070]0-联寡糖：N-聚糖和0-聚糖都通过产牛蛋白质的细胞而与该蛋白连接。当初生 蛋白质从核糖体向内质网移动时，细胞的N-糖基化机构识别氨基酸链中的N-糖基化信号 (N-X-S/T 基序）并使之糖基化（Kiely 等，1976 ;Glabe 等，1980)。
[0071]同样，0-聚糖连接到氨基酸链中的特异性0-糖基化位点，但触发0-糖基化的基 序与N-糖基化信号相比要异质得多，并且我们对氨基酸序列中0-糖基化位点的预测能力 尚不充分（Julenius等，2004)。因此，人工0-糖基化位点的构建有一些不确定性。
[0072]疏水件侧基的连接：可伸用化学方法讲行闵子FVIII分子与疏水性侧基的缀合。 然而，使用酶促方法具有很多潜在优势。根据本发明优选的酶促方法，可经化学方法制备 [疏水性延长基团]-唾液酸基-CMP底物。使用唾液酸转移酶，可经酶促方法将该底物转 移到因子FVIII上存在的聚糖上。本发明的发明人已经出乎意料地证明无需添加任何有机 溶剂就可进行这种酶促方法。使用有机溶剂有很多的不利条件，例如丧失生物活性、环境问 题、确保完全除去有机溶剂所采取的额外步骤等。也有可能可避免加入环糊精，环糊精是一 种去垢剂，也可造成生物功能的损失。在酶促缀合过程中，添加甘油，例如5-30%甘油，优选 10-20%甘油，可能是有利的。甘油的存在似乎例如在冷冻/融解过程中稳定因子VIII分 子，并且它还可防止形成因子VIII结晶。因此，在缀合过程完成之后，无需除去酶促缀合期 间所存在的甘油。
[0073]唾液酸转務酶：唾液酸转務酶是将唾液酸转務到初牛寡糖h的酶。每种唾液酸转 移酶对特定的糖底物具有特异性。唾液酸转移酶将唾液酸添加到唾液酸化糖脂（神经节苷 脂）的末端部分或添加到糖蛋白的N-联糖链或0-联糖链上。存在大约20种不同唾液酸 转移酶，其可根据它们所作用的受体结构和它们所形成的糖键类型而区分。本发明优选的 唾液酸转移酶是ST3Gal-I (对0-聚糖具有特异性）和ST3Gal-III (对N-聚糖具有特异 性）。因此有可能通过例如选择特异性唾液酸转移酶和/或改造具有特定糖基化模式的因 子VIII分子，对本发明的缀合的因子VIII分子的结构进行改造。
[0074]药物组合物：药物组合物在本文优诜意指包括包含本发明因子VIIII分子的适于 胃肠外给药用的组合物，例如即用型无菌含水组合物或可在例如水或含水缓冲液中重构的 干燥的无菌组合物。本发明的组合物可包含多种药学上可接受的赋形剂、稳定剂等。
[0075] 在这类组合物中的额外成分可包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节 剂、螯合剂、金属离子、油性溶媒、蛋白质（例如人血清白蛋白、明胶或蛋白）和两性离子 (例如氨基酸，例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸）。这类额外成分当然 不应对本发明药物制剂的总体稳定性有不利影响。胃肠外给药可通过使用注射器任选笔样 注射器经由皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射而进行。或者，胃肠外给药可通过输注栗的方 式而进行。进一步的选项是组合物，其可以是以鼻或肺部喷雾的形式给予FVIII化合物的 溶液剂或混悬剂。作为再一个进一步的选项，含有本发明FVIII化合物的药物组合物也可 适于透皮给药，例如通过无针注射或贴剂（任选离子电渗贴剂），或透黏膜给药例如口腔给 药。
[0076] 本文所用的术语"治疗"是指对有需要的任何人类或其它动物受试者的医学治疗。 预期所述受试者已经历医师的体检，所述医师已经做出试验性或确定性诊断，表明使用所 述特定治疗对所述人类或其它动物受试者的健康而言是有益的。所述治疗的时机和目的可 依据受试者的健康现状而因不同个体而异。因此，所述治疗可以是预防性的、治标的、针对 症状的和/或治愈性的。
[0077] 第一方面，本发明涉及重组因子VIII分子，其中所述因子VIII分子是包含因子 VIII分子和融合配偶体的融合蛋白。在第一实施方案中，所述融合配偶体置换了因子VIII 分子的a3结构域。因此，因子FVIII的小的a3结构域可被融合配偶体全部或部分置换。在 第二实施方案中，所述融合配偶体插入到因子VIII的B结构域中。B结构域可以是全长B 结构域，但在一个优选的实施方案中，B结构域是显著截短的。因此在融合配偶体的N-末 端和C-末端有至少3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸来自8结构域。在另一个优选的实施方 案中，所述融合配偶体插入到或位于因子FVIII的C2结构域的C-末端。
[0078] 在第三实施方案中，本发明的因子VIII分子与抗体结合分子例如Fc受体融合。抗 体结合分子的实例列于下表中。在第四实施方案中，因子VIII分子与具有与人血清白蛋白 结合的能力的分子融合。在另一个实施方案中，因子VIII与转铁蛋白融合。其实例也在下 文提供。在第五实施方案中，因子VIII分子与具有与血小板结合的能力的分子融合，这类 分子的具体实例同样在下文提供。在再一个实施方案中，因子VIII分子与具有与因子VIII 清除受体结合的能力的分子融合。
[0079] 在第六实施方案中，本发明的因子VIII分子具有降低的vWF结合能力。优选地， 这类因子VIII分子在跨越SEQ ID N01的氨基酸1670-1684的区域内包含突变（氨基酸的 取代、缺失或添加）。最优选地，这类因子VIII分子包含一个以下点突变：Y1680F、Y1680R、 Y1680N、和 E1682T、和 Y1680C。
[0080] 在第七实施方案中，本发明的分子与侧基缀合。该侧基可选自以下列出的一种或 多种：亲水性聚合物、肽和疏水性侧基。优选地，侧基是PEG基团、脂肪酸衍生物或多肽。优 选地，使用酶促方法将这类侧基连接到分子上，所述方法为例如W00331464中所公开的技 术，其中〇-联聚糖和/或N-联聚糖用作接头。
[0081] 本发明的另一方面涉及与融合配偶体融合的FVIII分子，其中所述融合配偶体置 换因子VIII分子的A3结构域。
[0082] 在一个实施方案中，所述融合配偶体是白蛋白。在另一个实施方案中，所述融合配 偶体是Fc受体。在另一个实施方案中，所述Fc受体是Fey RI。在另一个实施方案中，所 述融合配偶体是Fc结构域。在另一个实施方案中，所述Fc结构域是具有降低的效应子功 能和/或增加的对新生儿Fc受体的亲和力的突变Fc结构域。在另一个实施方案中，所述 融合蛋白与侧基缀合。在另一个实施方案中，所述侧基通过N-联聚糖和/或0-联聚糖连 接到融合蛋白。在另一个实施方案中，所述侧基通过唾液酸连接到N-联聚糖和/或0-联 聚糖。在另一个实施方案中，所述侧基选自以下列出的一种或多种：亲水性聚合物、肽和疏 水性侧基。在另一个实施方案中，所述FVIII分子是B结构域截短的分子，其中B结构域包 含SEQ ID NO 2所示的序列。在另一个实施方案中，所述融合蛋白在包含SEQ ID NO 2所 示氨基酸序列的截短的B结构域中包含与0-联聚糖连接的侧基。在另一个实施方案中，因 子VIII分子具有降低的vWF结合能力。在另一个实施方案中，具有降低的vWF结合能力的 因子VIII分子包含选自以下列出的突变：Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。
[0083] 本发明的另一方面涉及与融合配偶体融合的FVIII分子，其中所述融合配偶体插 入到因子VIII的B结构域中。
[0084] 在一个实施方案中，所述融合配偶体是白蛋白。在另一个实施方案中，所述融合配 偶体是Fc受体。在另一个实施方案中，所述Fc受体是Fey RI。在另一个实施方案中，所述 融合配偶体是Fc结构域。在另一个实施方案中，所述Fc结构域是具有降低的效应子功能 和/或增加对的新生儿Fc受体的亲和力的突变Fc结构域。在另一个实施方案中，所述融 合蛋白与侧基缀合。在另一个实施方案中，所述侧基通过N-联聚糖和/或0-联聚糖与融 合蛋白连接。在另一个实施方案中，所述侧基通过唾液酸连接到N-联聚糖和/或0-联聚 糖。在另一个实施方案中，所述侧基选自以下列出的一种或多种：亲水性聚合物、肽和疏水 性侧基。在另一个实施方案中，所述FVIII分子是B结构域截短的分子，其中所述B结构域 包含SEQ ID N0 2所示的序列。在另一个实施方案中，所述融合蛋白在包含SEQ ID N0 2所 示氨基酸序列的截短的B结构域中包含与0-联聚糖连接的侧基。在另一个实施方案中，因 子VIII分子具有降低的vWF结合能力。在另一个实施方案中，具有降低的vWF结合能力的 因子VIII分子包含选自以下列出的突变：Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。
[0085] 本发明的另一方面涉及与融合配偶体融合的FVIII分子，其中所述融合配偶体插 入到因子FVIII的C2结构域的C-末端。
[0086] 在一个实施方案中，所述融合配偶体是白蛋白。在另一个实施方案中，所述融合配 偶体是Fc受体。在另一个实施方案中，所述Fc受体是Fey RI。在另一个实施方案中，所述 融合配偶体是Fc结构域。在另一个实施方案中，所述Fc结构域是具有降低的效应子功能 和/或增加的对新生儿Fc受体的亲和力的突变Fc结构域。在另一个实施方案中，所述融 合蛋白与侧基缀合。在另一个实施方案中，所述侧基通过N-联聚糖和/或0-联聚糖连接 到融合蛋白。在另一个实施方案中，所述侧基通过唾液酸连接到N-联聚糖和/或0-联聚 糖。在另一个实施方案中，所述侧基选自以下列出的一种或多种：亲水性聚合物、肽和疏水 性侧基。在另一个实施方案中，所述FVIII分子是B结构域截短的分子，其中所述B结构域 包含SEQ ID N0 2所示的序列。在另一个实施方案中，所述融合蛋白在包含SEQ ID N0 2所 示氨基酸序列的截短的B结构域中包含与0-联聚糖连接的侧基。在另一个实施方案中，因 子VIII分子具有降低的vWF结合能力。在另一个实施方案中，具有降低的vWF结合能力的 因子VIII分子包含选自以下列出的突变：Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。 [0087]另一方面涉及