I，2. 5 mg/ml， EC 2. 4. 99. 4，WO 2006102652)和59毫克胞苷一磷酸妒5'-PEG-甘油-神经氨酸（在290 微升中，参见W02007/056191)，并用HC1 (1M)将pH调节到6. 9。终体积为2. 7 mL。然后 让所得混合物在22-25摄氏度（室温）下静置22小时。
[0111] 糖聚乙二醇化（glycopegylation)之后，混合物用缓冲液A (含Tris (25 mM)、氯 化钙（10 mM)、吐温80 (0.02 %)和甘油（1 M)的水，pH 7. 5)稀释至50 ml。将稀释混合 物上样到 Source30Q柱（GE Healthcare Bio-Sciences, Hillerad, Denmark,柱体积 1.1 mL)。然后用缓冲液A (4倍柱体积）洗涤固定化材料，再用0-100 %缓冲液B (含Tris (25 禮)、氯化钙（10禮)、吐温80 (0.02 %)、氯化钠（0.7 M)和甘油（1 M)的水，pH 7. 5)的 梯度从柱中洗脱。梯度：8 CV 5-10 %缓冲液B，13. 5 CV 10-100 %缓冲液B和3 CV 100% 缓冲液B。
[0112] 将早期洗脱的2. 5 mL峰流分与1. 2毫克胞苷一磷酸，5'乙酰基-神经氨酸（在 12微升中）和62微克唾液酸转移酶（在52微升中，MBP-SBD-ST3Gal-III，EC 2. 4. 99. 6， 参见 W0 2006102652)混合。
[0113] 让所得混合物在22-25摄氏度（室温）下静置22小时，然后上样到SuperdeUOOpg 柱（GE Healthcare Bio-Sciences, Hillerad, Denmark;柱体积 120 ml)。然后用由以下 成分组成的缓冲液洗脱产物：含L-组氨酸（1. 5 g/L)、L-甲硫氨酸（55 mg/L)、氯化钙（250 mg/L)、吐温80 (0.1 g/L)、氯化钠（18 g/L)和鹿糖（1.5 g/L)的水，pH 6.9。分离并合 并最初的含产物的流分（12 mL);产物浓度为大约0. 06 mg/mL。
[0114] 最终，通过在Amicon Centriprep YM-50 (截止值：50 kDa)中离心而浓缩产物。浓 缩后体积为1.7 mL，含有0.35 mg/mL糖聚乙二醇化的F8-500-白蛋白-Aa3 (纯度>90%)。 该化合物在表12中称为40K-PEG-0-F8-500-白蛋白-Aa3。
[0115] 实施例8 通过显色测定而测量的纯化样品中的FVIII:C 如下在显色FVIII测定中，使用Coatest SP试剂（Chromogenix)评价纯化rFVIII化 合物（按照实施例5所公开的方法而分离）的FVIII活性（FVIII :C) :rFVIII样品和FVIII 标准品（例如根据NIBSC的第7届国际FVIII标准品而标定的纯化野生型rFVIII)在 Coatest 测定缓冲液（50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 % BSA, pH 7. 3,含防腐剂）中稀释。 将50 W样品、标准品和缓冲液阴性对照一式两份加入到96孔微量滴定板（Nunc)中。将来 自Coatest SP试剂盒的因子IXa/因子X试剂、磷脂试剂和CaCl2按照5:1:3 (体积比）混 合，并取75 W加入到孔中。在室温下温育15 min之后，加入50 W因子Xa底物S-2765/ 凝血酶抑制剂1-2581混合物并将反应物在室温下温育10 min，然后加入25 W 1 M柠檬 酸，pH 3。在Spectramax微量滴定板读板器（Molecular Devices)上，测定在415 nm处 吸光度和在用作参考波长的620 nm处的吸光度。从所有样品中减去阴性对照值并通过吸 光度值对FVIII浓度作图的线性回归来制作标定曲线。通过样品活性除以经HPLC测得的 蛋白质浓度而计算比活。对于HPLC，通过对在对应于轻链的色谱图中的峰下面积进行积分 而求出样品浓度，并与野生型rFVIII的平行分析中同样的峰的面积进行比较，其中通过氨 基酸分析测定浓度。结果见表1-10。
[0116] 实施例9 通过一步法凝血测定而测量的纯化样品中的FVIII: C 如下在一步法FVIII凝血测定中进一步评价rFVIII化合物的FVIII: C :rFVIII样品和 FVIII标准品（例如根据NIBSC的第7届国际FVIII标准品而标定的纯化野生型rFVIII) 在邢5/85厶缓冲液（2〇111111印68、15〇1111恥(：14117.4，含1%85厶）中稀释至大约10 1]/ ml，再在含VWF而缺乏FVIII的血浆（Dade Behring)中稀释10倍。样品随后在HBS/BSA 缓冲液中稀释。在ACL300R或ACL5000仪器（Instrumentation Laboratory)上，使用单因 子程序，测定APIT凝血时间（clot time)。含VWF而缺乏FVIII的血浆（Dade Behring)用 作测定血楽，且 SynthASil, (HemosIL?, Instrumentation Laboratory)用作 aPTT 试剂。 在凝血仪器中，在37°C，将稀释的样品或标准品与缺乏FVIII的血浆、aPTT试剂混合。加入 (assed)氯化钙并用浊度确定血块形成的时间。根据FVIII标准品稀释液的血块形成时间 的标准曲线来计算样品中的FVIII :C。结果见表1-10。
[0117] 实施例10 在FVIII缺陷型和VWF缺陷型小鼠中FVIII构架和融合蛋白的药代动力学 在FVIII缺陷型小鼠（具有C57B1/6背景的FVIII外显子16敲出（K0)小鼠，在Taconic M&B繁育）或在vWF缺陷型小鼠（具有C57B1/6背景的vWF外显子4 + 5 K0小鼠，在 Charles River, Germany繁育）中评价rFVIII变体的药代动力学。vWF-K0小鼠具有13% 的正常FVIII: C (参见实施例6)，而FVIII-K0小鼠没有可检测的FVIII: C。使用近似体重 为25克，年龄范围在16-28周龄的雄性和雌性的混合群体（大约1:1)。小鼠在尾静脉接受 rFVIII (280 IU/kg)的单次静脉注射。在给药后直到64小时的时间点，使用无包被毛细玻 璃管，从眼窝丛处采血。每只小鼠采3份样品，每一时间点采2-4份样品。用柠檬酸钠立即 稳定血液并在4倍体积FVIII Coatest SP缓冲液（参见实施例6)中稀释，然后在4000 X g离心5分钟。将得自稀释血液的血浆在干冰上冷冻并保存于-80°C。按照实施例6所述， 在显色测定中检测FVIII:C。通过无房室（non-compartmental)法（NCA)，使用WinNonlin Pro 4.1版软件，进行药代动力学分析。结果见表12。用融合蛋白的半衰期除以无融合配 偶体的FVIII构架的半衰期，求出融合蛋白的延长倍数。
[0118] 实施例11 与血小板结合的融合蛋白的分析 可通过流式细胞术测定融合蛋白的血小板结合。可纯化外周血血小板，或可使用全血。 血小板可被激活或静止。将血小板与融合蛋白温育15-30 min。融合蛋白可直接用荧光团 标记或用荧光标记的第二抗体检测。
[0119] 可加入不干扰融合蛋白结合的荧光标记的血小板特异性抗体，以评价与融合蛋白 结合的颗粒是否真的是血小板。温育之后，洗涤细胞以除去融合蛋白，然后在流式细胞仪上 分析样品。流式细胞仪检测未标记的细胞和与细胞结合的荧光标记的分子，并且因此可用 于特异性地分析融合蛋白与血小板（或其它细胞）结合的程度。
[0120] 可例如通过加入过量的未标记抗体（当使用直接标记的融合蛋白时），评价结合 特异性。可例如通过加入过量的膜联蛋白V或FVIII，评价FVIII部分与血小板的结合。
[0121] 可如下评价通过静止血小板对融合蛋白的内在化：例如通过将血小板与直接标记 的融合蛋白一起温育，再与抗体一起温育，所述抗体猝灭来自表面结合（即非内在化的）融 合蛋白的信号。然后仅内在化的融合蛋白才可被流式细胞术检测到。可假定被激活的血小 板将会在血块形成部位释放内在化融合蛋白。
[0122] 实施例12 在GPIIIa转基因小鼠中GPIIIa靶向的融合蛋白的药代动力学 GPIIIa靶向的融合蛋白与血小板上的人GPIIb/IIIa (整联蛋白a2b3)受体结合，但它 不能识别鼠GPIIb/IIIa，这防止使用野生型小鼠用于药代动力学分析。可在表达人GPIIIa 的转基因小鼠中分析GPIIla靶向的融合蛋白的药代动力学特性，所述人GPIIla与鼠GPIIb 关联，这使融合蛋白能够与该受体结合。将融合蛋白经静脉内注射到GPIIIa转基因小鼠， 并在注射之后的不同时间点（例如0. 5、24、72、288小时）采血。可通过￡1154的方式定量 测定注射的融合蛋白（游离的和/或与血小板结合的），或可将融合蛋白放射性标记或荧光 标记并检测。
[0123] 表1.可构成融合蛋白FVIII部分的BDDFVIII构架
*显色测定/凝血测定 **在细胞培养收获物中测定（高值可代表ELISA检测不良） 表2.与FcRn相互作用的融合蛋白
*显色测定/凝血测定 **在细胞培养收获物中测定（高的值可代表ELISA检测不良） 表3.与免疫球蛋白相互作用的融合蛋白
*显色测定/凝血测定 **在细胞培养收获物中测定（高的值可代表ELISA检测不良） 表4.具有降低与清除受体的相互作用的能力的融合蛋白
*显色测定/凝血测定 **在细胞培养收获物中测定（高的值可代表ELISA检测不良） 表5.与血小板结合的融合蛋白
*显色测定/凝血测定 **在细胞培养收获物中测定（高的值可代表ELISA检测不良） 表6.与血清白蛋白相互作用的融合蛋白
*显色测定/凝血测定 **在细胞培养收获物中测定（高的值可代表ELISA检测不良） 表7.保护分子避免清除受体的融合蛋白
*显色测定/凝血测定 **在细胞培养收获物中测定（高的值可代表ELISA检测不良） 表8.具有经调节的vWF亲和力的融合蛋白
*显色测定/凝血测定 **在细胞培养收获物中测定（高的值可代表ELISA检测不良） 表9.其它融合蛋白
*显色测定/凝血测定 **在细胞培养收获物中测定（高的值可代表ELISA检测不良） 表10.具有经调节的脂质亲和力的融合蛋白
*显色测定/凝血测定 **在细胞培养收获物中测定（高的值可代表ELISA检测不良） 表11.实施例5所述的纯化过程的典型收率
.： 表12. FVIII构架和融合蛋白在FVIII缺陷型或vWF缺陷型小鼠中的体内半衰期
*显色测定/ELISA。
【主权项】
1. 一种重组FVIII分子，其中所述FVIII分子是融合蛋白，其包含FVIII分子和融合配 偶体，其中所述融合配偶体是Fc受体。2. 权利要求1的分子，其中所述Fc受体选自Fcy RI和Fcy RII。3. 权利要求2的分子，其中所述Fc受体是Fe Y RI。4. 前述任一项权利要求的分子，其中所述分子与侧基缀合。5. 前述任一项权利要求的分子，其中所述侧基选自下述一种或多种：亲水聚合物、肽 和疏水性侧基。6. 权利要求5的分子，其中所述侧基是亲水性聚合物。7. 权利要求6的分子，其中所述亲水性聚合物是PEG。8. 权利要求6的分子，其中所述亲水性聚合物是非天然存在的修饰的糖。9. 前述任一项权利要求的分子，其中所述FVIII分子具有降低的vWF结合能力。10. 权利要求9的分子，其中所述FVIII分子包含Y1680F点突变。11. 前述任一项权利要求的分子，其中所述Fc受体插入FVIII的B结构域。12. 前述任一项权利要求的分子，其中所述融合配偶体插入FVIII中C2结构域的C末 端中。13. 前述任一项权利要求的分子，其中所述FVIII分子是B结构域截短的分子，其中所 述B结构域在截短的B结构域中仅包含一个O-聚糖。14. 权利要求1-13中任一项的分子在制备用于治疗血友病的药物中的用途。15. -种药物组合物，其包含权利要求1-13中任一项的分子。
【专利摘要】本发明涉及经修饰的凝血因子。具体地讲，本发明涉及缀合的因子VIII分子，所述因子VIII分子与诸如抗体结合蛋白或Fc结构域等多肽融合。
【IPC分类】C07K19/00, A61K47/48, A61P7/04, A61K38/37
【公开号】CN105153313
【申请号】CN201510524808
【发明人】G.博尔特, K.克杰加尔德, P.L.诺尔比
【申请人】诺沃—诺迪斯克有限公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2011年2月10日
【公告号】CN102770450A, CN102770450B, EP2536754A1, US20130040889, WO2011101284A1