本发明分子的制备方法，其中所述方法包括在合适条件下温育编码 所述分子的宿主细胞。因此，本发明也涉及包含编码本发明分子的核酸序列的核酸分子以 及表达载体和宿主细胞。经由这类方法获取的或可经由这类方法获取的分子同样是本发明 的一个方面。
[0088] 另一方面涉及本发明分子作为药物的用途。
[0089]另一方面涉及本发明分子用于治疗血友病、优选A型血友病的用途。
[0090] 另一方面涉及包含本发明的分子和任选一种或多种药学上可接受的赋形剂的药 物组合物。
[0091] 本发明的另一方面涉及血友病的治疗方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗 有效量的本发明分子。 实施例
[0092] 实施例1 FVIII构架和融合配偶体 本发明的融合蛋白由与来自另一蛋白的多肽（融合配偶体）连接的FVIII蛋白（FVIII 部分）组成。
[0093] 融合蛋白的FVIII部分可以是具有FVIII活性的任何蛋白。FVIII部分可以是B 结构域缺失的/截短的（BDD) FVIII蛋白，其中FVIII B结构域部分已从该蛋白上切除。 可构成融合蛋白的FVIII部分的FVIII构架的非限制性实例见表1。F8-500是一种BDD人 FVIII蛋白。从N-端开始，F8-500由FVIII信号肽（氨基酸-19至-1)、后接无B结构域 的 FVIII HC (氨基酸 1-740)、21 个氨基酸的接头（SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR) (SEQ ID N0 2)和FVIII LC (野生型人FVIII的氨基酸1649-2332)组成。21个氨基酸的接头序列源 自FVIII的B结构域并由全长野生型人FVIII的氨基酸741-750和1638-1648组成。
[0094] F8-500- A a3由无a3区的F8-500组成。在F8-500- A a3中，将野生型人FVIII的氨 基酸1647-1687从F8-500中除去。因此，氨基酸1645-1648处的弗林蛋白酶位点已被破坏。 然而，合并的弗林蛋白酶和凝血酶位点是由在F8-500-A a中的R1645-H1646-P1688-R1689 氨基酸段所产生的。a3区对于FVIII与vWF的结合而言是重要的并因此与野生型FVIII相 比，降低了 F8-500-A a3对vWF的亲和力。
[0095] F8-500-His由具有插入到F8-500接头的His标签的F8-500组成。因此 F8-500-His 的接头序列是 SFSQNSRHPSHHHHHHSQNPPVLKRHQR (SEQ ID N0 3)。
[0096] F8-500- A a3-Hi s由无a3区、但具有插入到F8-500接头的Hi s标签的F8-500组 成。因此，在F8-500-Aa3-His中，野生型人FVIII氨基酸1647-1687已从F8-500中除去 并且接头序列是 SFSQNSRHPSHHHHHHSQNPPVLKRHQR (SEQ ID N0 4)。
[0097] F8-500-Y1680F 和 F8-500-Y1680C 由 F8-500 组成，其中全长野生型人 FVIII 的氨 基酸1680已从酪氨酸分别变为苯丙氨酸和半胱氨酸。这两个氨基酸置换降低了 FVIII对 vWF的亲和力。此外，Y1680C氨基酸置换引入游离半胱氨酸，其可用作将延长部分与融合蛋 白缀合的柄（handle)。
[0098] 可将融合配偶体与融合蛋白的FVIII部分的若干位置连接。用于连接融合配偶体 的FVIII上的位置的非限制性实例是在介于FVIII HC和LC之间的B结构域或B结构域衍 生的接头中的位置，在a3的位置，和在FVIII LC的C-端。
[0099] 实施例2 编码FVIII构架和融合蛋白的表达载体的构建 FVIII和融合配偶体间的融合都涉及用于扩增融合配偶体的PCR。将限制位点加入到 所用的PCR引物的末端。限制酶用于克隆融合配偶体cDNA或合成DNA为FVIII cDNA。
[0100] 在F8-500的B结构域中的融合发生在aa750和aal638之间。在B结构域内或其 侧翼的限制位点AvrII、Nrul、Agel和Mlul用于插入编码融合配偶体的DNA。
[0101] 对于在FVIII轻链羧基端的融合，修饰F8-500编码构建体。通过定点诱变消除内 部BamHI位点（aa 604-606)并将编码柔性（GGGS)6接头的DNA插入到编码区3'。将一个 新的BamHI位点引入编码接头的DNA的3'端，以便于将C-端融合配偶体克隆到BamHI位 点和Notl位点之间。然后，插入融合配偶体DNA。来自该构建体的融合蛋白在表2-12中称 为F8-500-C2-连接的-(GGGS) 6-X。类似于（GGGS) 6接头，将最小GS-接头（BamHI限制位 点）插入到F8-500编码区3'端。BamHI限制位点（GGATCC)形成GS (甘氨酸-丝氨酸） 的两个密码子。来自该构建体的融合蛋白在表2-12中称为F8-500-C2-连接的-GS-X。没 有任何接头的情况下与F8-500的C-端的融合如下进行：通过用延伸引物PCR扩增融合物， 所述延伸引物在5'端带有F8-500编码区最后的109 bp和在PCR产物的3'端具有Notl 限制位点。Xbal限制位点存在于离F8-500终止密码子的104-109 bp处。Xbal限制酶和 Notl限制酶用于克隆无接头的融合配偶体。来自后面这些构建体的融合蛋白在表2-12中 称为F8-500-C2-连接的-X。
[0102] 为了在a3位置插入融合配偶体编码DNA并由此在编码蛋白中用融合配偶体置换 a3,将SacII限制位点引入a3编码区的3'。因此，融合配偶体编码DNA可通过插入Agel位 点和SacII位点之间或者AvrII位点和SacII位点之间而引入。
[0103] hFc (SEQ ID NO 5)
转铁蛋白（SEQ ID NO 8)
SC 抗 GPIIIa-1-HC-LC (SEQ ID NO 15)
ELP80 (SEQ ID NO 21)
[0104] 实施例3 FVIII构架和融合蛋白的瞬时表达 密度为〇. 9-1. 1 x 106的HKB11细胞用质粒0. 7 mg/1和转染剂293Fectin (Invitrogen) 1.4 ml/1的混合物转染。通过将质粒和转染剂分别稀释在0PTIMEM (Invitrogen)中，混合这两种溶液，并将混合物在室温下温育20分钟，来制备转染混合物。 将混合物加入到细胞悬液中并将悬液在振荡器培养箱中在36. 5°C和5% C02中温育5天。将 细胞培养收获物在〇. 22 Mm膜滤器上过滤。按照实施例5所述，从细胞培养收获物中纯化 FVIII构架和融合蛋白。
[0105] 实施例4 表达融合蛋白的稳定的细胞 适应无血清的CH0-DUKX-B11细胞用编码F8-500-白蛋白-Aa3融合蛋白的表达质粒 转染。转染后的细胞用二氢叶酸还原酶系统选择并通过有限稀释而克隆。通过ELISA和显 色活性测定来筛选产生FVIII的克隆。选择克隆JsJH009用于扩大规模（upscaling)。将 细胞移至生物反应器。按照实施例5所述，从细胞培养收获物中纯化F8-500-白蛋白-Aa3 融合物。
[0106] 实施例5 FVIII构架和融合蛋白的纯化 给柱填装树脂VII ISelect (GE Healthcare)，其尺寸为：直径1.6cm和床高4cm (8mL);并将柱用 20mM 咪唑+10mM CaCl2+0.01% 吐温 80 (Tween80)+250mM NaCl, pH7.3 以 500cm/h平衡。将按照实施例3所述制备的培养物滤液上柱，然后先用平衡缓冲液洗涤柱 子，再用 20mM 咪唑+10mM CaCl2+0. 01% 吐温 80+1. 5M NaCl, pH7. 3 洗涤柱子。结合的 FVIII 用 20mM 咪唑+10mM CaCl2+0. 01% 吐温 80+2. 5 M NaCl+6. 5M 丙二醇，pH7. 3,以 90cm/h 等度 洗脱。合并含有FVIII的流分并用20mM咪唑+10mM CaCl2 + 0. 01%吐温80，pH7. 3 1:10 稀释，然后上样到填装有F25_Sepharose的柱上（Thim等，Haemophilia, 2009)。柱尺寸 为直径1. 6cm和床高2cm，柱体积4mL。使用前，柱子用20mM咪唑+ 10mM CaCl2 + 0. 01%吐 温80 + 150mM NaCl + 1M甘油，pH7. 3,以180cm/h平衡。上样后，先用平衡缓冲液洗涤 柱子，再用 20mM 咪唑 + 10mM CaCl2 + 0. 01% 吐温 80 + 650mM NaCl, pH7. 3 洗涤柱子。结 合的 FVIII 用 20mM 咪唑 + 10mM CaCl2 + 0.01% 吐温 80 + 2.5M NaCl + 50%(v/v)乙二 醇，pH7. 3,以30cm/h等度洗脱。合并含有FVIII的流分并用20mM咪唑+ 10mM CaCl2 + 0. 01%吐温80，pH7. 3 1:15稀释，除了缺失a3结构域的FVIII-变体之外，其在相同缓冲液 中1:45稀释。将稀释的合并液上样到填装有Poros 50HQ (PerSeptive Biosystem)的柱子 上，柱尺寸为直径0. 5cm和床高5cm，柱体积lmL。使用前，柱子用20mM咪唑+ 10mM CaCl2 + 0. 01%吐温80 + 50mM NaCl + 1M甘油，pH7. 3,以300cm/h平衡。柱子用平衡缓冲液洗 涤，然后用从平衡缓冲液至以下溶液的在5个柱体积内的线性梯度洗脱：20mM咪唑+ 10mM CaCl2 + 0. 01%吐温80 + 1M NaCl + 1M甘油，pH7. 3。合并含有FVIII的流分并将合并 液贮存于-80°直至使用。典型纯化的收率表见表11。
[0107] 基本上如上所述地纯化具有HIS-标签的FVIII变体，然而第二纯化步骤 (F25_sepharose)替换为装有 2 个柱体积 1M NiS04的螯合 Sepharose FF (GE Healtcare)。 柱尺寸为直径0. 5cm和床高5cm，柱体积lmL。使用之前，柱子用30mM咪唑+ 10mM CaCl2 + 0. 01%吐温80 + 1. 5M NaCl, pH7. 3，以180cm/h的流速平衡。上样后，柱子用30倍柱体积 的平衡缓冲液洗涤，然后用在5个柱体积内到250mM咪唑+10mM CaCl2 + 0. 01%吐温80+ 1. 5M NaCl, pH7. 3的线性梯度洗脱。合并含有FVIII的流分并用20mM咪唑+ 10mM CaCl2 + 0.01%吐温80，pH7. 3 1:30稀释。最终的纯化步骤（Poros 50HQ)如上所述地进行。
[0108] 实施例6 通过显色测定而测量的细胞培养收获物中的FVIII :C 在显色FVIII测定中，使用Coatest SP试剂（Chromogenix)如下评价细胞培养收获 物（上清液部分）中的冲￥111化合物的？￥111活性$￥111:〇:冲￥111样品和？￥111标准 品（Coagulation reference, Technoclone)在Coatest测定缓冲液（50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 % BSA，pH 7. 3,含防腐剂）中稀释。将50 W样品、标准品和缓冲液阴性对照加 入到96 孔微量滴定板（Spectraplates MB, Perkin Elmer)。所有样品都以 1:100、1:400、 1:1600和1:6400稀释再测定。将来自Coatest SP试剂盒的因子IXa/因子X试剂、磷脂 试剂和CaCl2按照5:1:3 (体积比）混合，并取75 W加入到孔中。在室温下温育15 min 之后，加入50 W因子Xa底物S-2765/凝血酶抑制剂1-2581混合物并将反应物在室温下 温育5 min，然后加入25 W 1 M柠檬酸，pH 3。在Envision微量滴定板读板器（Perkin Elmer)上，测定在405 nm处吸光度和在用作参考波长的620 nm处的吸光度。从所有样品 中减去阴性对照值并通过吸光度值对FVIII浓度作图的线性回归来制作标定曲线。通过样 品活性除以经ELISA测得的蛋白质浓度而计算比活。结果见表1-10。
[0109] 实施例7 FVIII构架和融合蛋白的纯化 融化溶于由以下成分组成的缓冲液的按照实施例5所述纯化的F8-500-白蛋白-A a3 (13 mg，6. 5 mg/ml):含咪唑（20 mM)、氯化钙（10 mM)、吐温80 (0? 02 %)、氯化钠（500 mM) 和甘油（1 M)的水（pH 7. 3)。
[0110] 加入9微克来自产脲节杆菌（AriAraAacter yrea/'acieas)的唾液酸酶（1. 9 U, 在7微升缓冲液中）、280微克唾液酸转移酶（在112微升中，His-ST3Gal-