液体回流型高速基因扩增装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本申请是申请日为2010年3月31日、申请号为201080022502.4、发明名称为“液体回流型高速基因扩增装置”的申请的分案申请。
[0002]本发明涉及一种适合于在基础生命科学、医学基础研究以及医疗现场中迅速地进行微量的基因分析的研究或临床的使用了反应容器的基因分析装置，并涉及使用基于例如以人类为首的动物或植物的染色体组DNA、信使RNA等的核酸碱基序列，快速检测特定的碱基序列的反应装置的基因分析。
【背景技术】
[0003]聚合酶链反应(Polymerase chain react1n，以下简记为PCR。)是基于各种核酸的混合物扩增特定的核酸序列的方法。在混合物中放入从染色体组DNA或信使RNA逆转录而生成的互补DNA等的DNA模板(template)、两种以上的引物(primer)和热稳定性酶、镁等的盐以及四种脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate) (dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，通过至少重复一次使核酸分离的工序、使所述引物结合的工序、以及通过热稳定性酶将结合有引物的核酸作为模板进行杂交的工序，能够扩增特定的核酸序列。通过使在DNA扩增反应中使用的反应容器进行升温、降温来进行热循环。用于使温度变化的机构能够举出各种机构，但是存在通过使用了加热器、珀尔帖元件或暖风的热交换使含有试样(sample)的反应容器的温度变化的机构、通过使反应容器与不同温度的加热部件(heaterblock)或液体池交替接触来使温度变化的机构、使试样在具有不同的温度的区域的流道中流动来改变温度的方法。在当前市场销售的装置中，就作为最快的装置的例如罗氏(Roche)公司的PCR仪(Light Cycler)而言，在多个玻璃毛细管的每一个中导入试料、DNA聚合酶、成为引物的DNA片段以及测量用的荧光标记染料，并吹送例如55°C和95°C两种温度等与想要变化的液滴的温度相同温度的暖风来使该毛细管内的微量液滴的温度变化，同时，向该玻璃毛细管照射荧光染料的激发光，并测量所得到的荧光强度。通过这些方法能够使试样的温度反复变化。
[0004]此外，提出了通过向含有试料区域的外壁喷射流体进行冲击，来控制试料温度的流体冲击热循环控制装置(日本特表2001-519224(专利文献I))。
[0005]现有技术文献
[0006]专利文献
[0007]专利文献1:日本特表2001519224
【发明内容】
[0008]发明要解决的问题
[0009]加热器或珀尔帖(Peltier)元件上的温度速度慢至每秒数°(:左右，此外，难以不对温度过调节(overshoot)就使温度变化。基本上，若利用固体中的热传导，则会在热源和表面之间形成热梯度，从而不能够进行严密的控制。此外，试样在与加热器或珀尔帖元件接触的瞬间被夺走热量，从而发生表面温度恢复到规定温度为止的延迟。此外，在使反应槽与不同的加热器或液体池接触的情况下，移动用的机构复杂，或难以进行加热器或液体池的温度控制。进而，在使试样在具有不同的温度区域的流道中流动的方法中，伴随着试样的移动，流道自身的表面温度发生变化，存在难以进行温度控制这样的问题。此外，在吹送暖风来使温度变化的情况下，由于空气的热容量少，必须吹送大量的空气，此外，同样由于空气的热容量少，将通过电热丝等吹送的空气的最终吹出温度以l°c为单位进行严密的控制是很困难的。
[0010]因此，本发明的目的在于提供一种能够进行正确的温度控制、温度测定以及迅速的升温、降温的反应控制装置。更具体地说，本发明的目的在于，提供一种能够进行正确的温度控制、温度测定以及迅速的升温、降温，由此能够进行高速、高精度、高扩增率的PCR反应的DNA扩增装置。
[0011]用于解决问题的手段
[0012]为了实现上述目的，本发明的反应控制装置具有以下特征:使用于针对试样液的温度变化，针对想要变化的多个温度，对维持各个温度的热容量大的液体进行热交换的介质中，以及使用了使该热容量大的多个不同的温度的液体高速变化的单元，和在该热容量大的液体和试样液之间迅速进行热交换微小反应槽。具体地说，由以下构成:微小反应槽，其以适合热交换结构以及材质构成；热交换槽，使适合各反应的温度的液体在微小反应槽外部循环；多个液体储存箱，含有高精度维持液体的温度的热源；切换阀系，为了使微小反应槽的温度迅速变化，用于从任意的液体储存箱向反应槽外部引导液体；混合防止机构，其在所述阀系切换时防止不同的温度的液体混合。
[0013]S卩，本发明提供以下的液体回流型反应控制装置。
[0014](I) 一种液体回流型反应控制装置，具有:
[0015]反应槽，其具有用于放入试样的一个或多个凹部，
[0016]热交换槽，其与所述反应槽相接触设置，以便向所述反应槽传递热量，并且，该热交换槽具有分别用于导入以及排出规定的温度的液体的入口以及出口，
[0017]多个液体储存箱，具有能够控制温度的热源，所述热源用于将所述多个液体储存箱的液体分别保持在规定的温度，
[0018]管状的流道，其将所述热交换槽的所述入口以及所述出口与所述液体储存箱相连接，
[0019]栗，其设置在所述管状的流道上，用于使所述液体在所述热交换槽与所述液体储存箱之间循环，
[0020]切换阀，其设置在所述管状的流道上，用于控制所循环的所述液体的流动，通过以规定的时间间隔切换来自所述多个液体储存箱的规定的温度的所述液体向所述热交换槽流入，由此将所述反应槽的温度控制在所希望的温度；
[0021]所述试样的量在每个凹部为数μ L以下，所循环的所述液体的总容积在每个液体储存箱为数十mL以上。
[0022](2)如上述⑴记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述液体回流型反应控制装置作为PCR装置来使用。
[0023](3)如上述⑴或⑵记载的液体回流型反应控制装置，其中，还具有荧光检测单元，在所述试样中含有荧光染料的情况下，所述荧光检测单元与对所述反应槽的温度切换动作连动地检测所述凹部内的所述荧光染料发出的荧光，以此测定荧光强度随时间的变化。
[0024](4)如上述(3)记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述荧光检测单元设置为与所述反应槽的各所述凹部相对应。
[0025](5)如上述(3)或(4)记载的液体回流型反应控制装置，其中，还具有:
[0026]估算单元，其基于在所述反应槽的一个或多个凹部中配置的所述试样液的荧光强度变化，来估算试样液的温度变化；
[0027]变化单元，其基于所述估算的结果，使所述反应槽的温度迅速变化。
[0028](6)如上述⑴?(5)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述液体储存箱的数量与所述反应槽的要设定的温度的数量相同。
[0029](7)如上述(6)所记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述液体储存箱的数量为2个或3个。
[0030](8)如上述⑴?(7)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述反应槽的底面以及壁面的厚度为I微米至100微米且由金属或硅形成，所述金属包括铝、镍、镁、钦、销、金、银、铜。
[0031](9)如上述⑴?⑶中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述凹部的底面的形状为平底状、半球状、三棱锥状或球状。
[0032](10)如上述(I)?(9)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，在所述凹部的每一个中预先内置反应中所需的干燥状态的试剂，该试剂与试样溶液接触时溶出并进行反应。
[0033](11)如上述⑴?(10)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述反应槽还具有用于使对于来自该反应槽内的所述试样的光学信号的测定变得容易的孔或光学窗。
[0034](12)如上述⑴?(11)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述反应槽设置为相对于所述热交换槽能够装卸。
[0035](13)如上述(12)记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述反应槽相对于所述热交换槽的装卸方式为以下方式中任一方式:
[0036](a)方式，在所述反应槽的外周设置筒状的框，在所述热交换槽上设置筒状的反应槽支座，并且，在所述反应槽的所述框的外表面和所述热交换槽的反应槽支座的内表面上设置有螺纹牙，通过沿着该螺纹牙的旋转运动，将所述反应槽能够装卸地安装在所述热交换槽上；
[0037](b)方式，将所述反应槽的外周的所述筒状的框以及所述热交换槽的所述筒状的反应槽支座分别设置成锥状，将所述反应槽能够装卸地压接在所述反应槽支座上；
[0038](c)方式，将所述反应槽固定在载玻片状的反应槽框内，在所述热交换槽的反应槽支座上设置有导轨，将所述载玻片状的反应槽框沿着该导轨能够装卸地进行安装；以及
[0039](d)方式，将所述载玻片状的反应槽框插入具有铰链的滑动支座，通过基于该铰链机构的旋转动作，将所述载玻片状的所述反应槽框能够装卸地安装在所述热交换槽的所述反应槽支座上。
[0040](14)如上述(12)或(13)记载的液体回流型反应控制装置，其中，还具有在特定状态下将所述反应槽从所述热交换槽卸下的机构，该特定状态是指，既能够维持使所述液体回流的状态，又能够不使所述液体向所述液体回流型反应控制装置的外部漏出的状态。
[0041](15)如上述⑴?(14)中任一项记载的液体回流型反应控制装置，其中，所述液体储存箱具有热源控制系统，所述热源控制系统具有热源、温度计、液体搅拌系统，该液体搅拌系统对该液体储存箱内的液体连续