BatchPrimerSvl. 0进行 目标区间内的引物设计。同样地，经亲本间PCR扩增和8 %的非变性聚丙締酷胺凝胶电泳检 测及小群体验证，最终获得QTL区间内多态性明显且带型清晰的SSR标记。
[0070]6、QTgw-4A. 1区间内SSR标记的筛选
[0071] 依据国际小麦基因组测序协会化ttp://www.wheatgenome.org/)发布的genome zipper及粗山羊草的genomezipper和90K小麦SNP基因忍片数据结果，进行千粒重主效 Q化区间内小麦与粗山羊草、小麦和短柄草的染色体共线性关系比对（图1)，找到粗山羊草 genomeZipper对应的位置，利用该区间内所包含的粗山羊草探针延伸序列、水稻基因序列 和短柄草基因序列，从小麦基因组测序协会数据库中提取获得小麦千粒重主效QTL区间内 的基因组序列。在此基础上，借助BatchPrimer3vl. 0进行目标区间内的引物设计。同样地， 经亲本间PCR扩增和8%的非变性聚丙締酷胺凝胶电泳检测及小群体验证，最终获得giL区 间内多态性明显且带型清晰的5对SSR标记。
[007引7、QTgw-4A. 1区间内的连锁图谱构建
[0073]W203个DH系为模板，利用区间上的所有标记，包括目标区间两端的SNP标记 IAAV8683和Excalibur_sl07592_195,区间内新开发的5个多态性SSR标记共7个标记进 行基因型检测，其中带型与亲本农大3338相同的记为A，与亲本京冬6号相同的记为B，缺 失记为借助JoinMap4.0进行遗传图谱构建，获得7个分子标记在目标区段上的最 优顺序及标记间新的遗传距离（图2,左侧数字表示各分子标记间的相对遗传距离，单位为 cM.) 〇
[0074] 8、目标QTL QTgw-4A. 1紧密连锁标记Xcaun23的获得
[00巧]针对203个DH群体，利用加密后的图谱信息，结合2008年和2009年北京和河北 石家庄的千粒重数据，利用WinQ化Cart2. 5软件，通过复合区间作图法，L0D阔值为2. 5,对 千粒重进行再次定位发现，均能在标记Xcaun23附近检测到控制千粒重的主效Q化，其加性 效应为1. 09g-l. 81g，可解释的表型变异为3. 76% -7. 97%，其增效位点均来自高千粒重亲 本京冬6号（表1)。
[0076] 表1为利用农大3338/京冬6号的DH群体再次检测到的QTgw-4A. 1的信息
[0077]
[0078] 用于扩增标记Xcaun23的SSR引物如表2所示：
[007引表2为Xcaun23标记的引物序列、退火溫度灯m)
[0080]
[0081]实施例2、Xcaun23标记SSR引物在鉴定小麦千粒重中的应用[008引1、基因组DNA的提取
[0083] 选取在2014年春播环境下山西和宁夏种植的农大3338和京冬6号的DH群体，使 其灌浆期在6-7月份，提取群体中各单株的基因组DNA。
[0084] 分别提取农大3338基因组DNA和京冬6号基因组DNA。
[0085] 2、PCR反应
[0086]W上述1获得的DH群体各单株基因组DNA、农大3338基因组DNA和京冬6号基因 组DNA为模板，用Xcaun23的SSR引物进行PCR扩增，得到SSR扩增产物。
[0087] 上述PCR扩增的PCR反应体系（10y1体系）如下表3 :
[008引表3为PCR反应体系
[0089]
[0090]PCR扩增的反应程序：94°C预变性5min;94°C变性30s、57°C复性30s、72°C延伸 30s，共36个循环；最后72°C延伸lOmin;12°C保存。
[0091] 8%的非变性聚丙締酷胺凝胶电泳检测SSR扩增产物，目标条带带型结果如图3所 示，SSR扩增产物中的目标条带有2种带型：A带型（190-2(K)bp)和B带型（170-175bp);农 大3338的SSR扩增产物为A带型，京冬6号的SSR扩增产物为B带型；二者的部分DH群体 中部分为A带型，部分为B带型。
[009引将农大3338 (A带型）、京冬6号度带型）、A带型的DH群体和B带型的DH群体 分别在山西和宁夏生长成熟后，测定并统计其千粒重大小。
[0093] 统计不同地区千粒重，结果表4、图4和图5所示，
[0094] 表4为山西、宁夏两点DH群体的千粒重统计结果
[0095]
[0096] 根据上述结果确定：
[0097] 不同地点评价高低千粒重标准不一致，运样会导致一个家系在山西是高千粒重， 但在宁夏是低千粒重。
[0098] 在山西地区，千粒重大于40. 94g的为高千粒重植株，千粒重小于等于40. 94g的为 低千粒重植株。
[0099] 在宁夏地区，千粒重大于46. 20g的为高千粒重植株，千粒重小于等于46. 20g的为 低千粒重植株。
[0100] 分析农大3338(A带型）、京冬6号度带型）、A带型的DH群体和B带型的DH群 体的结果如下：
[0101]山西地点的DH群体203个株系中有101株为A带型、102株为B带型。101株为 A带型山西DH群体中小于等于40. 94g低千粒重植株的有67株，占66. 34% ;102株为B带 型山西DH群体中大于40. 94g的高千粒重植株有67株，占65. 69%。
[010引宁夏地点的DH群体203个株系中有101株为A带型、102株为B带型。101株为A带型宁夏DH群体中小于等于46. 20g低千粒重植株的有57株，占56. 44% ; 102株为B带 型山西DH群体中大于40. 94g的高千粒重植株有65株，占63. 74%。
[010引因此，可W通过Xcaun23的SSR引物扩增待测小麦的基因组DNA，检测SSR扩增产 物带型，根据带型辅助鉴定待测小麦是否为高千粒重植物；
[0104] 上述根据带型辅助鉴定待测小麦是否为高千粒重植物为如下：
[0105] 若待测小麦的SSR扩增产物目标条带的带型为B带型，则待测小麦候选为高千粒 重小麦；
[0106] 若待测小麦的SSR扩增产物目标条带的带型为A带型，则待测小麦候选为低千粒 重小麦。
[0107] 也可W根据带型辅助鉴定待测小麦的千粒重性状：B带型的待测小麦的千粒重高 于A带型的待测小麦的千粒重。
[0108] 待测小麦为农大3338和京冬6号的DH群体，且其灌浆期在6-7月份。
[0109]另外，小麦为喜凉作物4子粒灌浆期时若遇到高溫环境则易导致产量减少和品质 降低（KumarandRai, 2014)。宁夏在6-7月份溫度为高溫环境，从表5可W看出，在高溫下 其千粒重仍然是B带型待测小麦大于A带型待测小麦，因此，也可W根据带型辅助鉴定待测 小麦的耐热性性状：B带型的待测小麦的耐热性高于A带型的待测小麦。
[0110] 上述实验中，2014年3月，在山西、宁夏两点通过春播的方式种植农大3338和京 冬6号及其衍生的DH群体，将小麦的成熟期推迟，实现了DH群体在灌浆期化-7月）的高 溫处理，说明该粒重主效的'L还可能与小麦的耐热性相关，是一个环境稳定且与小麦耐热 性相关的粒重主效QTL。利用该紧密连锁标记Xcaun23可快速有效地筛选出具有京冬6号 基因型的高千粒重小麦，节约实验成本，提高选择效率，加速小麦高产育种的进程。
【主权项】
1. 用于鉴定小麦千粒重的引物，为如下1)或2): 1) 由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成； 2) 将1)所示引物对中的一个或几个剪辑进行缺失、增加或替换得到具有相同功能的 引物对。2. 用于鉴定小麦千粒重的试剂，包括权利要求1所述的引物。3. 根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述试剂中，所述引物中的各条引物的浓 度均为10umol/L。4. 用于鉴定小麦千粒重的试剂盒，包括权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述 的试剂。5. 权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在 鉴定待测小麦是否为高千粒重小麦中的应用； 或权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在 鉴定待测小麦是否为高耐热性小麦中的应用； 权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在鉴 定小麦千粒重性状中的应用； 或权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在 鉴定小麦耐热性性状中的应用； 或权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在 筛选尚千粒重小麦中的应用； 或权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在 筛选耐热小麦中的应用。6. -种鉴定小麦千粒重的方法，包括如下步骤： 1) 用权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂扩增待测小麦，得到SSR扩 增产物； 2) 检测所述SSR扩增产物目标条带的带型是A带型还是B带型，若待测小麦的SSR扩 增产物带型为B带型，则待测小麦候选为高千粒重小麦； 若待测小麦的SSR扩增产物带型为A带型，则待测小麦候选为低千粒重小麦； 所述A带型的大小为190-200bp; 所述B带型的大小为170-175bp。7. -种鉴定小麦千粒重性状的方法，包括如下步骤： 1) 用权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂扩增待测小麦，得到SSR扩 增产物； 2) 检测所述SSR扩增产物目标条带的带型是A带型还是B带型，B带型的待测小麦的 千粒重高于A带型的待测小麦； 所述A带型的大小为190-200bp; 所述B带型的大小为170-175bp。8. -种鉴定小麦耐热性状的方法，包括如下步骤： 1)用权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂扩增待测小麦，得到SSR扩 增产物； 2)检测所述SSR扩增产物目标条带的带型是A带型还是B带型带型，B带型的待测小 麦的耐热性高于A带型的待测小麦； 所述A带型的大小为190-200bp; 所述B带型的大小为170-175bp。9. 根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述扩增的模板为待测小麦的 基因组DNA。10. 权利要求6或7所述的方法在筛选高千粒重小麦中的应用； 或权利要求8所述的方法在筛选耐热小麦中的应用。
【专利摘要】本发明公开了小麦粒重主效QTL？QTgw-4A.1的紧密连锁标记及其应用。本发明提供了用于鉴定小麦千粒重的引物，由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成。本发明筛选的与千粒重主效QTL紧密连锁的SSR标记Xcaun23，可以在苗期有效筛选出不同粒重大小的小麦株系，节约实验成本，快速筛选出千粒重高的小麦株系，提高选择效率，加速小麦高产育种的进程。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105200143
【申请号】CN201510690615
【发明人】彭惠茹, 关攀锋, 贾立加, 逯腊虎, 张金波, 赵月, 倪中福, 尤明山, 解超杰, 姚颖垠, 辛明明, 胡兆荣, 孙其信
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月22日