完全培养基制备单细胞悬液后转入培养瓶，置 37 °C，5 %C〇2, 95 %湿度的解箱中培养。
[0023] 本发明还提供了对永生化人肝癌血管内皮细胞系EC畑CC-I的鉴定方法，包括：
[0024] E、血管内皮细胞形态学和表型分析
[00巧](1)透射电镜检测经CD31免疫磁珠联合流式细胞仪双分选技术提取并培养的肝 癌血管内皮细胞，观察细胞质中具有血管内皮细胞特征性的Webel-Palade小体； 阳0%] (2)激光共聚焦显微镜检测CD31与CD105和vWF等内皮细胞标志物在SV40-LT转 染细胞上的共表达。
[0027]F、血管内皮细胞功能检测
[0028] 用经典的内皮细胞功能检测方法包括Transwell小室迁移，划痕迁移W及管腔形 成，观察SV40-LT转染后的细胞的运些功能变化。
[0029] G、转染细胞潜在恶变的检测
[0030] 将SV40-LT基因整合后的ECD肥C-I细胞注射到裸鼠皮下，定期观察动物成瘤情 况，W排除细胞的致瘤潜在性。
[0031] 本发明从人肝癌组织中提取原代血管内皮细胞，采用SV40-LT慢病毒（见图1)转 染细胞，并经过药物筛选和流式细胞仪单细胞分选纯化，其内皮细胞标志物CD31的表达为 99.7% (见图2)。进行单克隆培养并传代至119代，历时18个月（截止保藏日期），其细 胞形态和活性W及生物学性能与原代细胞保持高度一致（见图3-图6)。最终，本发明成功 地构建了一株永生化人肝癌血管内皮细胞系ECD肥C-I。 阳03引本发明进一步提供了ECD肥C-I质控方法和血管内皮细胞表型的分析：（1)实时定 量PCR验证显示，转染阳性细胞的SV40-LT基因表达Ct值为19循环数（见图7)，与空载比 较，说明ECD肥C-I已含有SV40-LT基因整合；（2)激光共聚焦显微镜检测到CD31与CD105、 vWF、ICAM等内皮标志物在ECD肥C-I上共表达（图5)，说明SV40-LT基因整合后的细胞仍 与原代细胞的内皮表型保持高度一致。 阳033] 本发明进一步提供了ECD肥C-I细胞功能验证：经transwell,划痕，管腔形成实 验，结果显示EC畑CC-I仍具有迁移和管腔形成能力的血管内皮细胞生物学特性（见图6)。
[0034] 本发明还提供了动物成瘤验证，对接受该细胞皮下注射的裸鼠观察了 2个月，尚 未见裸鼠皮下成瘤，排除了携带SV40-LT基因的EC畑CC-I潜在的恶变性。
[0035] 本发明的第S方面，提供了永生化人肝癌血管内皮细胞系EC畑CC-I的应用。
[0036]用本发明提供的ECD肥C-I细胞为实验对象（材料），研究了Dicer、miRNA-210、 FGF化-I对血管调控的作用。采用过表达或基因沉默技术，发现Dicer、miRNA-210过表达 时，细胞迁移功能增强（见图8)，而当用基因沉默FGF化-1时，ECDHCC-I细胞的迁移力明显 受抑制（图9)。说明了运些效应与在正常血管内皮细胞中的研究结果相对应。
[0037] 本发明的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECD肥C-I为研究肿瘤血管生成的调控机 制提供了细胞材料。
[0038] 本发明的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECD肥C-I为血管祀向抗癌药物的筛选提 供了细胞模型，尤其是应用于抗肝癌药物的筛选、抑制血管内皮细胞增殖药物的筛选等。
[0039] 本发明的有益效果如下：
[0040] 1.血管内皮细胞源于人肝癌手术标本，能真实地反映肿瘤血管生物学特性，因此 优于既往用正常血管内皮细胞作研究材料来筛选血管祀向抗癌药物。
[0041] 2.本发明首次采用SV40-LT慢病毒载体工具转染人原代培养肿瘤血管内皮细胞， 打破了无永生化人肿瘤血管内皮细胞模型的纪录。
[0042] 3.本发明首次采用流式细胞仪单细胞分选，提取和纯化肿瘤血管内皮细胞；
[0043] 4.本发明首次进行肿瘤血管内皮细胞单细胞水平体外培养，W及单克隆传代，其 传代培养历时长达18月之久，至保藏日期共计119代（并且将继续传代观察），其生物学特 性保持一致；
[0044] 5.本发明首次采用精确先进的检测仪器和相关功能的手段，进行多角度全面分析 ECD肥C-I的血管内皮细胞特性。
[0045] 6.本发明的永生化人肝癌血管内皮细胞系将彻底改善本领域相关研究者只能采 用"现用现取"的细胞制备方法，W致每次都需要消耗大量时间的现状，做到了省时、省力、 高效，同时也弥补了人肝癌手术标本的资源匿乏。
[0046] 7.本发明为本技术领域的相关研究者提供了商品化的稳定的肿瘤源性血管内皮 细胞系，将为研究肿瘤血管生成机制W及血管祀向药物筛选提供便利而又充足的细胞原材 料。
[0047] 生物材料样品的保藏信息：
[0048] 保藏单位：中国典型培养物保藏中屯、 W例地址：中国武汉武汉大学
[0050] 保藏日期：2015年10月15日
[0051] 保藏编号：CCTCCNO:C2015172
[0052] 分类命名：永生化人肝癌血管内皮细胞系ECD肥C-I
【附图说明】
[0053] 图I为SV40-LT慢病毒载体构建示意图。
[0054] 图2为流式细胞仪单细胞分选CD31强阳性细胞W及细胞纯度分析，P4为分选设 n。 阳05引 图3为EC畑CC-1单克隆传代培养的显微镜下细胞状态，其中叩29，P38，P54，P122" 表示第29, 38, 54,122代；"200X"表示显微镜的放大倍数。
[0056] 图4为ECD肥C-I细胞的透射电镜下W-P小体超微结构。箭头指向细胞质里1粒 W-P小体。
[0057] 图5为激光共聚焦显微镜分析EC畑CC-I细胞的内皮标志物表达，其中箭头所指为 CD31 分别与CD105、VEGFR-2、vWF、ICAM共定位表达。
[0058] 图6为血管内皮细胞功能鉴定；其中A为transwell小室迁移实验结果；B为划痕 迁移实验结果；C为管腔形成。
[0059] 图7为实时定量PCR验证转染后ECD肥C-I细胞中SV40-LT基因表达。SV40-LT阳 性细胞Ct值（循环数）为19,说明SV40-LT慢病毒转染率极高。图8为miRNA-210过表 达或FGF化-1沉默后ECD肥C-I细胞transwell小室迁移能力改变。其中A示miRNA-210 基因通过慢病毒载体（LV)转入EC畑CC-I细胞，与空载比较明显增加；B示对照组空载转染 ECD肥C-I细胞迁移；C示miRNA-210过表达（LV-miR210)时，细胞transwell小室迁移能力 增强（结晶染色阳性颗粒增加）；D示3个病毒（shRNA-Fl，shRNA-F2,shRNA-F3)分别转染 ECD肥C-I细胞，其中ShRNA-Fl抑制FGF化-1表达最明显；E对照组空载时ECD肥C-I细胞 transwell小室迁移；F.当ShRNA-Fl沉默FGF化-1基因时，细胞transwell小室迁移能力 明显下降（结晶染色颗粒明显减少）。
[0060] 图9为Dicer或miRNA-210过表达时ECD肥C-I划痕迁移功能增强。其中A、B分 别为Dicer、miRNA-210基因通过慢病毒载体转入ECD肥C-I细胞引起两个分子表达比较明 显增加；C、D分别为Dicer、miRNA-210过表达时ECD肥C-I细胞划痕迁移增强。
【具体实施方式】
[0061] 现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
[0062] 下述实施例如无特殊说明所用方法均为常规方法。
[0063] 实施例1 :人肝癌血管内皮细胞系ECD肥C-I的建立、传代
[0064] 1.分离提取人肝癌（中分化）组织血管内皮细胞及原代培养： W65] 1. 1.经知情同意和医学伦理批准，取人肝癌（中分化）手术切除新鲜标本，制备 单细胞悬液：将组织液、红细胞及冰基础培养基冲洗干净后组织剪成碎块，移入装 有10血0. 5%的I、IV型胶原酶混合Hank'S溶液中，37°C解育25min，10%BSA/PBS终止 消化，用不同规格针头注射器反复抽吸细胞悬液，经70ym、40ym滤器过滤细胞悬液，在 4°C100化/min离屯、lOmin，弃上清后再作单细胞悬液，并在细胞悬液中加入面ase酶，防止 细胞成团。
[0066] 1. 2.免疫磁珠分选：CD31免疫磁珠及磁珠分选系统购自德国美天妮生物技术有 限公司。每60yL(IxlO6个）细胞悬液，加入40yLCD31免疫磁珠抗体