只鼠龄六周半免疫功能低下的裸鼠，在其背部皮下注射1. 3X106个 /200yL邸CHCC-I细胞，定期观察皮下成瘤情况。
[0094] 结果显示：注射细胞后每周观察动物，直至2个月后3只荷瘤裸鼠都未见成瘤。说 明可排除携带SV40-LT基因的ECD肥C-I的潜在恶变性。 阳0巧]3. 5.定期检测不同代数ECD肥C-I细胞表达SV40-LT基因情况，确保转染的稳 定性。参照实时定量PCR相对定量实验指南ABI 7300-7500,按其常规检测转染细胞中 SV40-LT基因表达水平。
[0096] SV40-LT引物如下：
[0097] SV40-F：TGGAACTGATGAATGGGAGCA(SEQIDN0:1),
[0098] SV40-R：GAGAGTCAGCAGTAGCCTCATCATC(SEQIDN0:2)〇
[0099] 结果显示：转染阳性细胞的SV40-LT基因表达Ct值为19循环数（见图7)，与空 载比较，说明ECD肥C-I已含有SV40-LT基因整合。 阳100] 综上所述，本发明一方面利用SV40-LT慢病毒有很强的侵入真核细胞（如人原代 培养细胞）及其所携带的SV40-LT容易整合到细胞的基因组，并且有无限复制的功能，另 一方面利用先进的流式细胞分选仪，进行单细胞分选纯化等运些优势，从肝癌患者肿瘤组 织里分离提取CD31阳性血管内皮细胞，经过上述慢病毒转染后进一步作单细胞分离培养， 对单克隆进行多方面的验证，最终结果显示：本发明提供的EC畑CC-I是一株纯化的，稳定 的而且有无限繁殖传代趋势的永生化人肝癌血管内皮细胞系，其生物学特性与原代的保持 高度一致，并且没有致癌性。 阳1〇U实施例3:永生化人肝癌血管内皮细胞系ECD肥C-I的应用实验
[0102] 将本发明提供的细胞系ECD肥C-I应用于基础研究：血管调控相关分子 Dicer (GENBANK NW-177438)、miRNA-210 (Accession :MIMAT0000267)、FGF化-1 (GENBANK NW-021923)对ECD肥C-I的功能影响。
[0103] 采用慢病毒载体携带运些目的基因或沉默运些基因转染EC畑CC-I细胞，验证确 认其有效转染，检测细胞功能改变。实验方法：参见Xiao F，Qiu H，Zhou X，Yang L, and Ding K. WSS25inhibits Dicer, downregulating micro民NA-210which targets Ephrin-A3, to suppress human micro-vascular endothelial cell (HMEC-I) tube formation. Glycobiology, 2013 ;23巧）：524-535,将携带Dicer基因病毒，miRNA-210基因 病毒，沉默（Sh)FGF化-I基因病毒（所有病毒购自上海吉凯生物有限公司）分别转入本发 明提供的ECDHCC-I细胞，采用实时定量PCR验证转染效率，测定细胞过表达或抑制的功能 改变。
[0104] 结果显示：当miRNA-210过表达时，transwell小室迁移能力增强，而当FGF化-I 基因沉默时，小室迁移能力下降（见图8)。当Dicer或miRNA-210过表达时，均引起ECD肥C-I细胞划痕迁移功能增强（见图9)。
[01化]通过本发明EC畑CC-I的应用性研究，结果提示了EC畑CC-I细胞能真正代表肿 瘤血管内皮细胞，可为研究肿瘤血管生成机制W及调控提供实质性的"原材料"。基于 EC畑CC-I具有高纯度、无限繁殖但无致瘤性的肿瘤血管内皮细胞特性，运就排除了异质性， 为今后血管祀向抗癌药物筛选的提供很好的基础材料。 阳106] W上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，运些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。
【主权项】
1. 一种永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1，其保藏号为CCTCCNO:C2015172,于 2015年10月15日保藏于中国典型培养物保藏中心。2. -种如权利要求1所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-I的构建方法，包括 以下步骤： A、 分离提取人肝癌组织血管内皮细胞，先进行CD31免疫磁珠分选，再用流式细胞仪分 选，进一步纯化⑶31阳性血管内皮细胞； B、 原代人肝癌血管细胞的培养，将步骤A获得的CD31阳性血管内皮细胞悬浮培养于 ECM完全培养基，37 °C，5 %CO2, 95 %湿度；ECM完全培养基的配方为ECM+5 %胎牛血清+1 % ECGS+青霉素100单位/mL+链霉素100yg/mL; C、 构建SV40-LT慢病毒载体，用SV40-LTM慢病毒转染步骤B培养的原代人肝癌血管细 胞，并进行嘌呤霉素筛选； D、 用流式细胞仪单细胞模板分选，纯化携带SV40-LT基因的CD31阳性血管内皮细胞。3. 根据权利要求2所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-I的构建方法，步骤A 具体为： 经知情同意和医学伦理批准，取人肝癌中分化手术切除新鲜标本，经酶消化分解组织， 制备单细胞悬液；随后进行CD31免疫磁珠分选，当细胞培养传代至6代时，用流式细胞仪分 选，进一步纯化⑶31阳性血管内皮细胞。4. 根据权利要求2所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-I的构建方法，步骤B 具体为： 将步骤A获得的⑶31阳性血管内皮细胞悬浮在T25培养瓶含ECM完全培养基，置37 °C， 5%CO2, 95%湿度的孵箱中培养；ECM完全培养基的配方为ECM+5%胎牛血清+1 %ECGS+青 霉素100单位/mL+链霉素100yg/mL。5. 根据权利要求2所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-I的构建方法，步骤C 具体为： 构建SV40-LT慢病毒载体，制备病毒，将SV40-LT病毒转入纯化的原代肝癌血管内皮 细胞，在培养中加入嘌呤霉素，筛选出阳性细胞并继续传代培养；用实时定量PCR仪检测转 染细胞中的SV40-LT基因表达，确认SV40-LT已整合到靶细胞的基因组里。6. 根据权利要求2所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-I的构建方法，步骤D 具体为： 收集经多次嘌呤霉素处理筛选的SV40-LT慢病毒转染细胞，用CD31荧光抗体染色，设 置流式细胞仪BDFACSAriaII单细胞分选模板，进行CD31阳性单细胞提取，机器自动收集 细胞到含有ECM完全培养基的96孔培养板，每孔1个细胞；当细胞培养形成单克隆后，胰酶 消化制备单细胞悬液，进行CD31抗体染色，进一步用流式细胞仪再次分析血管内皮细胞的 纯化度。7. 根据权利要求2所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-I的构建方法，步骤D 之后还包括：传代培养、冻存、复苏。8. -种如权利要求1所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-I的鉴定方法，包括 以下步骤： E、 血管内皮细胞形态学和表型分析； F、 血管内皮细胞功能检测； G、 转染细胞潜在恶变的检测。9. 一种如权利要求1所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-I在研究肿瘤血管 生成调控机制中的细胞材料应用。10. -种如权利要求1所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-I在血管靶向抗癌 药物筛选中的细胞模型应用。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域。本发明提供了一种永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1，其保藏号为CCTCC？NO：C2015172，于2015年10月15日保藏于中国典型培养物保藏中心。本发明还提供了ECDHCC-1的构建方法和鉴定。本发明获得的细胞系经单克隆传代，传代培养历时长达18月之久，至保藏日期共计119代，其生物学特性保持一致；本发明的细胞系彻底改善了目前研究肿瘤血管只能“现用现取”的烦琐程序以及人肝癌手术标本的资源匮乏现状，为相关研究者提供了商品化的稳定的肿瘤源性血管内皮细胞系，真正做到省时、省力、高效、便利。CCTCC NO：C201517220151015
【IPC分类】C12Q1/02, C12N15/867, C12N5/10
【公开号】CN105219732
【申请号】CN201510684793
【发明人】杨俐萍, 赵文静, 钱红燕, 陈旭东, 张一心, 强福林
【申请人】杨俐萍, 南通市肿瘤医院
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月21日