录和/或翻译。表达载体可W是质粒、病 毒或核酸片段、或其它合适媒介的一部分。典型地，表达载体包括与启动子操作性连接的待 转录的核酸。
[0050] "诱导型启动子"是在响应特定刺激物时介导操作性连接的基因转录的启动子。
[0051] "操作性连接"是两个核酸序列例如控制序列（典型地，启动子）和所连接的序列 (典型地，编码蛋白的序列，也称为编码序列）之间的功能性连接。如果启动子可介导外源 基因转录的话，则该启动子与该外源基因操作性连接。
[0052] "裂解物"是含有已裂解的细胞的内容物的溶液。
[005引"裂解化ysis)"是生物体的质膜和任选细胞壁的破裂，其足W释放至少一些胞内 内容物，通常通过机械、病毒或渗透机制破坏其完整性而达到。
[0054]"裂解化ysing)"是破坏生物体或细胞的细胞膜和任选细胞壁，其足W释放至少一 些胞内内容物。
[00巧]"渗透休克"是在突然降低渗透压后溶液中的细胞破裂。有时诱导渗透休克W将所 述细胞的细胞组分释放到溶液中。
[0056]术语"质粒"、"载体"和"盒"是指额外的染色体组件，其通常携带并非细胞重要 代谢的部分的基因，并且通常呈环状双链DNA分子的形式。运类组件可W是来自任何来源 的自主复制序列、基因组整合序列、隧菌体或核巧酸序列、线状或环状的单链或双链DNA或 RNA，其中许多核巧酸序列已经连接或重组到独特构建体中，所述构建体能够将启动子片段 和所选基因产物的DNA序列W及合适的3'非翻译序列引入细胞中。"转化盒"是指含有外源 基因并具有除外源基因外的组件的特定载体，所述组件促进特定宿主细胞转化。"表达盒" 是指含有外源基因并具有除外源基因外的组件的特定载体，所述组件允许增加该基因在外 来宿主中的表达。
[0057]"启动子"是指导核酸转录的核酸控制序列。如本文使用的，启动子包括临近转录 起始位点的必要的核酸序列。启动子也任选地包括远端增强子或阻遏组件，其可距离转录 起始位点多达数千个碱基对。
[0058]"重组体"是已经因引入外源核酸或改变天然核酸而被修饰的细胞、核酸、蛋白或 载体。因此，例如，重组细胞可表达在细胞的天然（非重组）形式内不存在的基因或者表达 不同于非重组细胞表达的那些基因的天然基因。重组细胞可W包括但不限于重组核酸，其 编码基因产物或抑制组件例如突变、剔除、反义、干扰RNA(RNAi)或dsRNA，所述抑制组件降 低细胞中的活性基因产物的水平。"重组核酸"是通常通过核酸的操纵（例如使用聚合酶、 连接酶、核酸外切酶和核酸内切酶）初始在体外形成的核酸，或另外呈在自然界并非正常 存在的形式。可W产生重组核酸，例如将两个或更多个核酸操作性连接起来。因此，用于本 发明的目的，分离的核酸或通过连接在自然界并非正常连接的DNA分子而体外形成的表达 载体，都被认为是重组体。一旦制备重组核酸并将其引入宿主细胞或生物体，它就可W使用 宿主细胞的体内细胞机制来复制；然而，运样的核酸，一旦经重组产生，尽管随后在胞内复 审IJ，但用于本发明的目的，仍然被认为是重组体。同样，"重组蛋白"是使用重组技术、即通过 重组核酸表达而制备的蛋白。
[0059]"超声处理"是通过使用声波能量破坏生物材料例如细胞的过程。
[0060]"转化"是指将核酸片段转入宿主生物体或宿主生物体的基因组，导致遗传上稳定 的遗传。含有已转化的核酸片段的宿主生物体称为"重组的"、"转基因的"或"转化的"生 物体。因此，可将本发明的分离的多核巧酸并入重组构建体、典型地DNA构建体，其能够引 入宿主细胞中并在其中复制。运样的构建体可W是包括复制系统和能够在指定宿主细胞中 转录和翻译多肤编码序列的序列的载体。典型地，表达载体包括例如，处于5'和3'调节序 列的转录控制之下的一个或多个已克隆的基因W及选择标记。运样的载体也可含有启动子 调节区（例如，控制诱导型或组成型的、环境或发育调节的或位置特异性表达的调节区）、 转录起始位点、核糖体结合位点、转录终止位点和/或聚腺巧酸化信号。
[0061]微牛物工括巧造 A.概沐 在本发明的某些实施方案中，微生物经遗传修饰W改良或提供在各种原料材料上从头 生长的特性。
[0062] 可将基因和基因产物引入微生物宿主细胞。用于表达基因和核酸分子的合适的 宿主细胞是运样的微生物宿主：其可W在真菌或细菌家族内广泛存在并且其在宽泛的溫 度、抑值和溶剂耐受性的范围内生长。合适的宿主菌株的实例包括但不限于：真菌或酵 母物种，例如曲霉（心_/〇6'知心心)、木霉（7>icAoofe/7ffi3)、酵母毕赤酵母 (巧cAia)、假丝酵母（仍/7扣(劫、汉逊酵母（偏ftseni/知)、克鲁维酵母;或 细菌物种，例如变形杆菌（proteobacteria)和放线菌（actinomycetes)W及W下特定属 的成员：不动杆菌妃Γ)、节杆菌妃Γ)、短杆菌（《reKiAac妃ri"曲)、 食酸菌Uciobrarax)、芽抱杆菌（《acinus)、梭状芽胞杆菌（C/o別rii/ia)、链霉 菌（沉巧〇扣巧rces)、埃希氏菌（仿cAericAia)、沙口氏菌（5?扣oneiia)、假单胞菌 {Pseudomonas)|Mf{Cornyebacterium)〇
[0063] 大肠杆菌很适合用作本发明发酵过程的宿主微生物。
[0064] 含有指导外来蛋白高水平表达的调节序列的微生物表达系统和表达载体是本领 域技术人员众所周知的。任何运些都可用于构建嵌合基因W产生本发明序列的任一基因产 物。然后可经由转化技术将运些嵌合基因引入合适微生物中W提供酶的高水平表达。
[0065]例如，可将编码酶的基因克隆入合适的质粒，并且可将上述起始亲代菌株作为宿 主，用所得质粒来转化。该方法可增加编码酶的各基因的拷贝数，并且作为结果，可增加运 些酶的活性。对质粒并无特别限制，只要它在微生物中可自主复制。
[0066] 用于转化合适宿主细胞的载体或盒是本领域众所周知的。典型地，载体或盒含有 指导相关基因转录和翻译的序列、选择标记和允许自主复制和染色体整合的序列。合适的 载体包含携带转录起始控制的基因5'区和控制转录终止的DNA片段的3'区。最优选的是 运两个控制区衍生自与所转化的宿主细胞同源的基因，尽管应当知道，运样的控制区不必 衍生自选作生产宿主的具体物种的天然基因。
[0067] 可通过克隆技术，使用分离自天然来源的片段，产生载体的启动子、cDNA和 3'UTR、W及其它组件（参见例如，MolecularCloning:AL油oratoryManual,Sambrook 等人（第3版，2001，ColdSpringHarborPress;和美国专利号4,683,202 (通过引用 结合））。或者，可使用已知方法经合成产生组件（参见例如，Gene. 1995Oct. 16:164(1): 49-53)。
[0068] B.同源電紀 同源重组是互补DNA序列与同源区比对和交换的能力。将含有与所祀向的基因组序列 ("模板"）同源的序列的转基因DNA("供体"）引入生物体中，然后在相应的基因组同源序 列的位点上经过重组到基因组中。
[0069] 在宿主生物体中携带同源重组的能力具有许多实用的启示，其可W分子遗传水平 携带并用于产生油质微生物，所述微生物可产生定制的油。通过其特有的性质，同源重组是 精确基因祀向事件，因此，用相同祀向序列产生的大部分转基因系将会在表型上基本相同， 需要筛选少得多的转化事件。同源重组也祀向基因插入宿主染色体的事件，可能导致优良 遗传稳定性，甚至是在缺乏遗传选择时。因为不同的染色体位点很可能影响基因表达，甚至 来自异源启动子/UTR，同源重组可W是在不熟悉的基因组环境中查询位点并评价运些环境 对基因表达的影响的方法。
[0070] 使用同源重组的一种特别有用的基因工程改造方法是补选特异性宿主调节元件 例如启动子/UTR，W高度特异性的方式驱动异源基因表达。
[0071] 因为同源重组是精确基因祀向事件，它可用于精确修饰目标基因或区域内的任何 核巧酸，只要已鉴定足够的侧翼区。因此，同源重组可W用作修饰影响RNA和/或蛋白的基 因表达的调节序列的工具。它也可用于修饰蛋白编码区，试图修饰酶活性，例如底物特异 性、亲和性和Km，并因此影响宿主细胞代谢的所需变化。同源重组提供了操纵宿主基因组的 有力的工具，导致基因祀向、基因转化、基因缺失、基因复制、基因倒位和交换基因表达调节 元件例如启动子、增强子和3'UTR。
[0072] 可通过使用含有内源序列片段的祀向构建体祀向"内源宿主细胞基因组内的 目标基因或区域而实现同源重组。运样的祀向序列可W位于目标基因或区域的5'、目标基 因/区域的3'，或甚至侧接目标基因/区域。可将运样的祀向构建体转化入宿主细胞，作为 具有额外载体主链的超螺旋的质粒DNA、无载体主链的PCR产物、或作为线性化的分子。在 一些情况下，有利的是首先将转基因DNA(供体DNA)中的同源序列暴露给限制酶。该步骤 可W提高重组效率并降低不想要的事件的出现。提高重组效率的其它方法包括使用PCRW 产生含有与所祀向的基因组序列同源的线性末端的转化的转基因DNA。
[0073] C.裁体巧裁体紀件 可W通过本领域技术人员已知的技术，考虑到本公开内容，制备用于本发明的微生物 转化的载体。载体典型地含有一个或多个基因，其中每个基因编码所需产物（基因产物） 的表达并且与一个或多个控制序列操作性连接，所述控制序列调苄基因表达或使基因产物 祀向重组细胞中的特定位置。
[0074] 本部分分为多个小节。小节1描述了通常在载体上含有的控制序列W及本发明提 供的新的控制序列。小节2描述了通常在载体上含有的基因W及新的密码子优化方法和使 用本发明提供的那些而制备的基因。
[00巧]1.控制序列 控制序列是调节编码序列表达或指导基因产物到细胞内或外的特定位置的核酸。调节 表达的控制序列包括例如，调节编码序列转录的启动子和终止编码序列转录的终止子。另 一控制序列是位于编码序列末端的3'非翻译序列，其编码聚腺巧酸化信号。指导基因产物 到特定位置的控制序列包括编码信号肤的那些，其指导它所连接的蛋白到达细胞内或外的 特定位置。
[0076] 因此，用于在微生物中表达外源基因的示例性的载体设计含有与在微藻类中具有 活性的启动子操作性连接的所需基因产物（例如选择标记或酶）的编码序列。或者，如果 载体不含有与目标编码序列操作性连接的启动子，则可将编码序列转化入细胞，使得它与 内源启动子在载体整合点上操作性连接。
[0077] 用于表达外源基因的启动子可W是与该基因天然连接的启动子或可W是异源启 动子。
[0078] 启动子通常可被表征为组成型或诱导型。组成型启动子通常是具有活性或功能W 在所有时间（或在细胞生命周期中的某些时间）W相同水平驱动表达。相反，诱导型启动 子仅在响应刺激物时才有活性（或失活）或被显著上调或下调。运两类启动子在本发明方 法中都找到应用。用于本发明的诱导型启动子包括在响应刺激物时介导操作性连接的基因 转录的那些，所述刺激物例如外源提供的小分子、溫度（热或冷）、培养基中缺氮等。合适的 启动子可W激活基本沉默的基因的转录或上调（优选大幅度地）W低水平转录的操作性连 接的基因的转录。
[0079] 包含终止区控制序列是任选的，并且如果用的话，则选择首先是方便的一个，因为 终止区是相对可互换的。终止区对于转录起始区（启动子）而言可W是天然的，对于目标 DNA序列可W是天然的，或者可W得自其它来源。参见例如，化en和化OZCO,NucleicAcids Res. (1988) 16:8411。
[0080] 2.基因和密码子优化 典型地，基因包括启动子、编码序列和终止控制序列。当通过重组DNA技术装配时，基 因可W被称为表达盒并且可W侧接限制位点，W便插入载体，所述载体用于将重组基因引 入宿主细胞。表达盒可W侧接来自基因组或其它核酸祀的DNA序列，W促进表达盒通过同 源重组而稳定整合到基因组中。或者，载体及其表达盒可W不整合（例如，附加体），在运种 情况下，载体典型地包括复制起点，其能够为异源载体DNA的复制做准备。
[0081] 载体上存在的常见基因是编码蛋白的基因，其表达允许将含有该蛋白的重组细胞 与不表达该蛋白的细胞区分开来。运样的基因，及其相应的基因产物，称为选择性标记或选 择标记。多种多样的选择标记的任一种都可用于转基因构建体，用于转化本发明的生物体。
[0082] 对于重组蛋白的优化表达，有益的是使用运样的编码序列，其产生具有所转化的 宿主细胞最佳使用的密码子的mRNA。因此，转基因的适当表达可需要转基因的密码子使用 与转基因在其中表达的生物体的特定密码子偏倚是匹配的。该效应的基础精确机制有许 多，但包括当该需要满足时，适当平衡可用的氨酷化tRNA池与细胞中所合成的蛋白质，同 时更有效翻译转基因信使RNA(mRNA)。当转基因中的密码子使用未被优化时，可用的tRNA 池不足W允许异源mRNA的有效翻译，导致核糖体停顿和终止并可能导致转基因mRNA的不 稳定性。
[0083] D.两个或审《个外源基闲的表武 此外，经基因工程改造的微生物可包含和表达不止一个外源基因。使用诱导型启动子， 可表达一个或多个基因，所述启动子允许运些受控基因按照相对时间来表达。两个或更多 个外源基因的表达可W是处于同一诱导型启动子控制之下或处于不同诱导型启动子的控 制之下。在后一种情况下，可在第一时期诱导第一个外源基因的表达（其间第二个外源基 因的表达可W或可W不被诱导），而可在第二时期诱导第二或更多个外源基因的表达（其 间第一个外源基因的表达可