Β培养基上经有氧培养至稳定期。然后将1/1000ν/ν接种物接种到相同的限定培养基 (含有或10ml脈、10ml双缩脈、或无额外氮）上并在相同条件下培养。72小时后测量光 密度，如图23所示。在含有双缩脈的培养基中，菌株NS98和NS99可生长至光密度大约两 倍于NS100,并且还大约是用无氮供应的培养基的两倍。运表明表达（'^^莖因的酿酒酵母 菌株在其利用双缩脈方面是有优势的。
[0154] 可用作在酿酒酵母中基因转录的启动子的DNA
连施例6 -Ξ聚氯胺同化酶在大肠巧菌中的表抹 通过使用上述的酵母介导的连接而构建载体，可将Ξ聚氯胺同化基因或它们的亚组在 大肠杆菌中表达。表达载体由W下组成：大肠杆菌功能性启动子、Ξ聚氯胺同化途径的酶的 编码基因、和大肠杆菌功能性终止子。或者，若干基因可W从作为基因操纵子的一部分的单 一启动子而表达；在运种情况下将基因间接头序列放置在基因间。可作为启动子、终止子和 接头的序列，W及两个代表性的大肠杆菌表达质粒，AJS67 (表达用于将Ξ聚氯胺降解为Ξ 聚氯酸并释放3N&/Ξ聚氯胺的基因）和AJS68 (表达用于将Ξ聚氯酸降解为NH3和C0 2并 释放3NVΞ聚氯酸的基因）列举如下。
[01巧]大肠杆菌Ptach启动子
参见图7和图8。 阳15引 连施例7 -氨腊同化酶在酿酒酵母中的表巧 实施例5所述的基因表达方法也可用于实施例7。经由脈簇化酶和脈基甲酸水解酶的 作用，酿酒酵母具有将脈转化为畑3和C0 2的天然能力，所述酶由融合基因DUR1，2编码。因 此，氨腊水解酶的功能性表达足W将氨腊转化为N&。代表性的氨腊水合酶表达载体如下所 示，W及解脂耶氏酵母TEF1启动子和终止子和经酿酒酵母密码子优化的来自痛抱漆斑菌 的氨腊水合酶。参见图9。 阳157] 连施例8-氨腊同化酶在±输惧藏中的表巧 实施例6所述的基因表达方法也可用于实施例8。不同于酿酒酵母，大部分大肠杆菌菌 株不能利用脈作为氮源，因此运些额外的转化步骤也必须经工程改造。除了氨腊水解酶之 夕F，还必须表达脈簇化酶/脈基甲酸水解酶系统或脈酶W及合适的辅助酶。脈酶可W在一 些大肠杆菌分离株中发现（Collins和化化OW1990)或经异源表达（化ssac等人，1992)。 或者，来自酿酒酵母的DUR1，2基因可连同氨腊水合酶一起被表达，如W下质粒AJS70所示。 参见图10。 阳15引 连施例9 聚氨眩同化酶在±嚇巧薦中的表抹 构建了含有部分或完整Ξ聚氯胺利用途径的若干大肠杆菌菌株，如图29和30所示。载 体和菌株构建如实施例6所述。所有载体含有氨节青霉素抗性基因，并将100ug/mL氨节 青霉素加入到所有培养基。运些菌株在含有不同氮源的MCPS限定培养基中生长。
[0159] 大肠杆菌菌株和Ξ聚氯胺利用基因 NS88 - (步骤 1) NS89 -trzA、guaD、trzCi巧驚1、2、？>) NS90-?rス化?rス公、DURl，2(步骤4、5、6) NS91 -无（对照菌株） NS93 -iriA天然巧Λ3化经选择用于改善Ξ聚氯酸二酷胺利用（步骤1、2) NS103 -化/人巧Λ3化 (步骤 1、2、3) NS109-?ri人巧Λ^化?rスC、?rスク 12227、?rス公、DURl，2(步骤l-6) NSllO-iriA巧Λ3化皆ateZ?ADP、皆如；DURl, 2 (步骤 1-6) 图12显示在含有不同浓度的氯化锭或Ξ聚氯胺的培养基中的NS88和NS91 (对照） 的生长进程。在1mlΞ聚氯胺上生长的NS88达到的光密度相当于同样利用2ml氯化锭 所达到的那样，表明iri斯日天然编码的guai湛因将2ml氨从Ξ聚氯胺中释放出来。对照 菌株NS91在用Ξ聚氯胺作为氮源时不生长。
[0160] 图13显示在含有不同浓度的氯化锭或双缩脈的培养基中的NS90和NS91(对照） 的生长进程。在1ml双缩脈上生长的NS90达到的光密度相当于同样利用3ml氯化锭所 达到的那样，表明巧日DUR1，2将3ml氨从双缩脈中释放出来。对照菌株NS91在用双 缩脈作为氮源时不生长。
[0161] 图24显示NS91、NS103、NS109和NS110在含有0. 25mMS聚氯胺作为唯一氮源 的培养基中的生长进程。在0-1. 5ml的不同氯化锭浓度上生长的所有4种菌株的平均值 也显示为限制氮的生长的标准曲线。在Ξ聚氯胺上生长的NS91类似于0ml氯化锭对照。 在0. 25mlΞ聚氯胺上生长的NS103类似于1 - 0. 75ml氯化锭，表明大约利用预测的3 ml氨/1mMS聚氯胺。在0. 25mMS聚氯胺上生长的菌株NS109和NS110类似于1.5 -1.25ml氯化锭，表明大约利用预测的6ml氨/1mlΞ聚氯胺。
[016引图25显示NS91、NS103、NS109和NS110在含有0.25mMΞ聚氯酸二酷胺作为唯一 氮源的培养基上的生长进程。在0-1. 5ml的不同氯化锭浓度上生长的所有4种菌株的平 均值也显示为限制氮的生长的标准曲线。在Ξ聚氯酸二酷胺上生长的NS91类似于0ml氯 化锭对照。在0. 25mlΞ聚氯酸二酷胺上生长的NS103类似于0. 5ml氯化锭，表明大约利 用预测的2ml氨/1mMS聚氯酸二酷胺。在0. 25mMS聚氯酸二酷胺上生长的菌株NS109 和NS110类似于1.25 - 1.0ml氯化锭，表明大约利用预测的5ml氨/ImMS聚氯酸二 酷胺。
[016引 图26、27和28显示衍生自大肠杆菌K12、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌B和大肠杆菌 化ooks(C)的大肠杆菌菌株，其含有具有完整Ξ聚氯胺利用途径的PNC121，或PNC53 ( - 种对照载体）。菌株的详情参见图29和30。含有PNC121的所有菌株能够在0. 5mMΞ聚氯 胺作为唯一氮源上生长（图28)。运表明Ξ聚氯胺利用途径对于通常用于生物技术应用的 大肠杆菌菌株而言是可广泛应用的。
[0164] 也可选择对Ξ聚氯胺衍生的氮源的改善的利用的菌株，在一个实例中，将NS88在 含有0. 5mlΞ聚氯酸二酷胺作为唯一氮源的MCPS限定培养基中传代，共11次连续转移。 最后一次传代后，分离单菌落，一个称为NS93。将NS93和NS91在含有0. 5ml氯化锭作为 唯一氮源的培养基上培养过夜，然后接种到含有0. 5πιΜΞ聚氯酸二酷胺作为唯一氮源的培 养基上。NS91在Ξ聚氯酸二酷胺上表现出最大生长率为0.024虹1，而NS93表现出最大生 长率为0.087虹1。
[01财培养基利用 培养物在37°C经有氧培养，用100mg/L氨节青霉素。预培养物在含100mg/L氨节青 霉素的LB培养基中生长，用等体积的不含氮的MCPS培养基洗涂一次，并W5%v/v的终发 酵体积接种。MCPS培养基的内容物概述于图11。
[0166] 在不同培养基中的培养物成像 预培养物在含100mg/L氨节青霉素的LB培养基中生长，将0.1mL直接接种到5mL含100mg/L氨节青霉素和指定氮源的MOPS培养基中。在鼓型滚筒（化umroller)中W30 巧m在37°C培养。参见图14。 阳167]连施例10 -绕工巧巧造P1刹用氨腊的牛物体生物体 NS100 -工业酿酒酵母菌株，带有PNC67OiygK，nat") NSlOl-工业酿酒酵母菌株，带有pNC93 (hygK,ca旬NSlll-酿酒酵母NRRLΥ-2223,带有pNC93OiygK，ca旬 NS112 -酿酒酵母NRRLΥ-2223,带有pNC67OiygK，nat") 参见图16。 阳16引在限定培养基中的氨腊的利用 在含有不同氮源的限定培养基上生长的NS100和NS101的光密度。将NS100和NS101 在YTO培养基中培养过夜，用等体积的无菌水洗涂一次，W3. 33%v/v接种。菌株NS101用 氨腊能够生长至光密度相当于用脈生长的光密度，而NS100生长至光密度相当于培养基中 无氮的那样。数据是在96孔板中3个重复孔的平均值；150化/孔。30°C，YNB培养基含有 20g/L葡萄糖，1.7g/LYNB基础培养基（无氨基酸或硫酸锭）、5g/L硫酸钢、100yg/mL 潮霉素、W及10ml脈、10ml氨腊或无氮源。用在含有脈作为氮源的相同培养基上预培养 24小时的5化培养物接种。参见图17。
[016引 另外，在 30°C，将菌株NS100、NS101、NS111 和NS112 在含有 10ml脈和 100μg/ mL潮霉素的限定YNB培养基中经有氧培养至稳定期。然后将1/1000v/v接种物接种到相 同的限定培养基（含有10ml脈、10ml氨腊、或无额外氮）上并在相同条件下培养。72小 时后测量光密度，如图22所示。菌株NS101和NS111，携带caA基因的两种不同的酿酒酵母 菌株，可生长至光密度相当于含有脈的那样；然而，NS100和NS112仅可生长至光密度等于 或小于在无氮源培养基中的那样。运表明多个酿酒酵母菌株在caA基因存在下能够利用氨 腊。
[0170] 在限定培养基中的竞争 将菌株NS100OiygK，nat")和NS101OiygK，ca旬在含有10〇μκ/ιΛ潮霉素和含有脈 作为氮源的限定培养基中培养，然后将运两者接种在含有10ml脈或10ml氨腊作为氮源 的限定培养基中。当生长达到稳定期后，按1/100v/v连续转移到具有相同组成的新鲜培 养基中。通过统计hygK，nat"菌落形成单位的数量并将其从hygK菌落形成单位的数量中减 去，监测培养物群体。对于在限定基本培养基中的一个实验，参见图18和图19。第二个实 验示于图21。第二个实验包括限定基本（YNB)培养基组成和限定复合（YNB+SC氨基酸）培 养基组成两者。限定YNB培养基含有20g/L葡萄糖、1. 7g/LYNB基础培养基（无氨基酸 或硫酸锭）、5g/L硫酸钢、W及10ml脈、10ml氨腊或无氮源。培养基组成在图32和33 中另外给出。生长在需氧条件下在30°C发生。通过在含有300yg/mL潮霉素或100yg/ mL诺尔丝菌素的YTO培养基中连续稀释，统计菌落形成单位，并且是3次稀释计数的平均 值。参见图18和图19。 阳171] 在加富培养基中的氨腊的利用 在含有100μκ/ιΛ潮霉素和有和无10ml氨腊的加富YPD培养基中生长的NS100和 NSlOl的光密度。将NSlOO和NSlOl在Yro培养基中培养过夜，并W3. 33%v/v接种。在10ml氨腊存在下，NS101经历的延迟期短于NS100。因此，氨腊，除了起到作为唯一氮源的作用 夕F，也可起到抑制微生物生长的作用。数据是在96孔板中3个重复孔的平均值；150μL 孔。30°C，YTO培养基或含有lOmM氨腊的YTO培养基。用在含有脈作为氮源的ΥΝΒ培养基 中预培养24小时的5化培养物接种。
[0172]参见图20。 阳17引连施例11-氨睛水合酶活忡测定法 本测定法检测氨腊向脈的转化率。在第一步骤中，氨腊水合酶将氨腊水合为脈，在表达caA基因的酿酒酵母菌株和无caA的对照菌株的无细胞提取物中对其检测。在测定的第二 步骤中，市售试剂盒（Megazyme，Irreland)用于检测脈，即通过将脈经酶促转化为氨，接着 是NADPH相关的将氨和2-酬戊二酸转化为NADP+、&0和谷氨酸。
[0174] 通过将酿酒酵母菌株在含有300μκ/血潮霉素的50mL酵母提取物、蛋白腺、葡萄 糖（YPD)培养基上生长至光密度介于1-2之间，制备无细胞提取物。通过离屯、收获细胞，在 等体积的水中洗涂一次，按照制造商说明书重悬于Y-Pm?裂解缓冲液CThermoScientific, USA)中。在室溫解育20分钟后，将裂解物在14,OOOxg离屯、10min并回收上清液作为无 细胞提取物。通过Nano化op分光光度计（ThermoScientific,USA)测定总蛋白。
[0175] 方案 在100化体积中总共加入： 10 化 50mlNaP04,pH7. 7 ; 10化200ml氨腊，新制备 5-20化无细胞提取物 平衡水化0化，对于20化WE) 将100uLW上样品加入到2. 9血Megazyme脈/氨测定试剂中并在340皿处监测。
阳17引 连施例12 -本发巧的示例件的序巧I 序列1是假单胞菌菌株ADP的脈基甲酸水解酶莖因的DNA序列。
[0177] 序列2是酿酒酵母的脈基甲酸水解酶DUR1，2基因的DNA序列。
[0178] 序列3是解脂耶氏酵母化IB122的脈基甲酸水解酶YALI0E07271g基因的DNA序 列。
[0179] 序列4是假单胞菌菌株ADP的双缩脈酷胺水解酶a盛因的DNA序列。
[0180] 序列5是假单胞菌菌株ADP的Ξ聚氯酸酷胺水解酶a?ζΖ湛因的DNA序列。
[0181] 序列6是假单胞菌菌株NRRLB-12227 (W前称为西瓜食酸菌Mciobwrax 的Ξ聚氯酸酷胺水解酶湛因的DNA序列。
[0182] 序列7是红球菌Mel的Ξ聚氯酸酷胺水解酶r础基因的DNA序列。
[018引序列8是大肠杆菌K12菌株MG1566的鸟嚷岭脱氨酶巧Λ3Ζ湛因的DNA序列。
[0184] 序列9是大豆慢生根瘤菌USDA 110的鸟嚷岭脱氨酶blr3880基因的DM序列。
[018引序列10是酿酒酵母的鸟嚷岭脱氨酶GUD1/YDL238C基因的DNA序列。
[0186] 序列11是解脂耶氏酵母化IB122的鸟嚷岭脱氨酶YALI0E2574化基因的DNA序列。
[0187] 序列12是威廉姆斯氏菌NRRL B-15444R ( W前称为珊瑚红球菌（乂 的Ξ聚氯胺脱氨酶基因的DNA序列。