W或可W不被诱导）。本文提供的是用于工程化微生物W在非 传统生长培养基上生长的载体和方法。
[0084]E.转化 可通过任何合适技术转化细胞，所述技术包括例如基因枪、电穿孔、玻璃珠转化和碳化 娃晶须转化。将转基因引入微生物的任何常规技术都可用于本发明。可W通过例如化M. Morrison的方法（MethodsinEnzymology68, 326 (1979))，用氯化巧增加受体细胞对 DNA的通透性的方法（Mandel,M.和Riga,A.，J.Mol.Biol., 53，159 (1970))等等， 来实现转化。
[00财转基因在油质酵母（例如，解脂耶氏酵母（/ai了oria化70如。心）中的表达实例 可W见于文献（参见例如，Bordes等人，JMicrobiolMethods，Jun. 27 (2007))。外源 基因在细菌例如大肠杆菌中表达的实例是众所周知的；参见例如，MolecularCloning:A L油oratoryManual,Sambrook等人（第 3 版，2001,ColdSpring化rborPress)。
[0086] 可通过本领域技术人员熟悉的已知方法制备用于转化本发明的微生物的载体。在 一个实施方案中，用于在微生物中表达基因的示例性的载体设计含有与在微生物中具有活 性的启动子操作性连接的酶的编码基因。或者，如果载体不含有与目标基因操作性连接的 启动子，则可将基因转化入细胞，使得它与内源启动子在载体整合点上操作性连接。载体 也可含有编码蛋白的第二基因。任选地，一个或两个基因后接着含有聚腺巧酸化信号的3' 非翻译序列。编码运两个基因的表达盒可W是物理地连接在载体中或在分开的载体上。 也可使用微生物共转化，其中不同载体分子同时用于转化细胞（参见例如，Protist2004 December;155(4) :381-93)。可W根据在抗生素或其它选择标记存在下在其中缺乏抗性盒 的细胞不生长的条件下生长的能力，来任选地选择已转化的细胞。
[0087] 原料中的含氮化合物 在某些实施方案中，本发明设及使用非典型的含氮原料，其包括式Ι-ΠΙ的任一个的 含氮化合物，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，非经基因工程改造的生 物体，即天然生物体，不能代谢（即，用作氮源）原料中的含氮化合物。
[0088] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述含氮原料，其中所述含氮化合物是式I 化合物或其盐：
其中，每次出现时独立地，
曼5-、6-、9-或10-元芳基或杂芳基； R是-0H、-%H、-N02、-CN、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的烷基讯η是 0、1、2、3、4 或 5。
[0089] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述含氮原料，其中所述含氮化合物是式 II化合物或其盐：
II 其中，每次出现时独立地， X是-畑-、-Ν(烷基）-、-〇-、-C脚)厂、-S-或不存在； Υ是-Η、-畑2、-Ν(Η)(烷基）、-Ν(烷基）2、-COzH、-CN或取代的或未取代的烷基；和Ri是-H、-0H、-C0 2山-N02、-CN、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的烷基。
[0090] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述含氮原料，其中所述含氮化合物是式 III化合物或其盐：
Ill 其中，每次出现时独立地， Y是-H、-畑2、-N(H)(烷基）、-N(烷基）2、-C02H、-CN或取代的或未取代的烷基。
[0091] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述含氮原料，其中所述含氮化合物选 自：
[0092]在某些实施方案中，本发明设及任一种上述含氮原料，其中所述含氮化合物选 自：阱、5-氨基四挫、四挫、Ξ聚氯胺、氨腊、2-氯基脈、叠氮化钢、碳酷阱、1，2,3-Ξ挫、 1，2, 4-Ξ挫、1，3-二氨基脈肥1、Ξ聚氯酸二酷胺、1，3, 5-Ξ嗦、氨基乙腊、氯基乙阱、偶氮 二甲酯胺、联二脈、氨基甲朽、1,2-二甲阱、1,1-二甲阱、乙阱、乙二胺、双氯胺钢、碳酸脈、 甲胺、Ξ聚氯酸一酷胺、径胺、丙二腊、双缩脈、二乙基Ξ胺、六亚甲基四胺、Ξ亚乙基四胺、 1，3-二氨基丙烷、Ξ亚乙基四胺、1，3-二氨基丙烷、径基脈、四亚乙基五胺、硫脈、班巧腊、 氯氨化巧、Ξ聚氯酸、氨基乙基赃嗦、赃嗦、二甲胺、乙胺、达伐化晚（dalfampridine)、四硝 基甲烧、咪挫烷基脈、Ξ硝基甲烧、丙二酷胺、氯胺、脈基甲酸、Ξ甲胺、硝基甲烧、乙醒朽、双 咪挫烷基脈（diazolidinylurea)、1，2-环己二酬二朽、丙酬目亏、硫代乙酷胺、硫氯酸钢、异 嚷挫、嚷挫、二甲基乙酷胺、异嚷挫嘟酬、亚甲蓝、二乙醇胺、天冬甜素、苯并异嚷挫嘟酬和乙 酷氨基横酸钟。
[0093] 示例件的分离的核酸分子和裁化 在某些实施方案中，本发明设及分离的核酸分子，其中所述核酸分子编码运样的酶：所 述酶为生物体提供同化天然生物体否则无法利用的氮源的能力；和所述酶是脈基甲酸水解 酶、双缩脈酷胺水解酶、Ξ聚氯酸酷胺水解酶、鸟嚷岭脱氨酶、Ξ聚氯酸二酷胺水解酶、Ξ聚 氯酸一酷胺水解酶、Ξ聚氯胺脱氨酶、异丙基Ξ聚氯酸一酷胺异丙基氨基水解酶、氨腊水合 酶、脈酶或脈簇化酶。
[0094] 在某些实施方案中，本发明设及分离的核酸分子，其中所述核酸分子选自来自红 球菌（化oobcocc化邱.）菌株Mel的ir如'、来自魏豆根瘤菌（化WwAi細？ 巧皿/nosary曲） 的ir如、ir^CMEL、皆乂" 12227、来自尖抱镶刀菌（巧wariu曲〇巧巧DOT歴)化5176的caA、来 自 jOsei/cfc併'3化/打aearu曲CS3096 的caA、来自玉米赤霉（仿'Mereiia^eae)PH-1 的caA、 来自白曲霉（心公6'知心化？左aracAii)IFO4308的caA、来自黑曲霉（A打古er)CBS513. 88 的caA、来自黑曲霉ATCC1015的caA、来自米曲霉〇4.ο巧為36) 3. 042的caA、来自酿酒酵 母（51cereKisiae)FostersB的caA、来自假单胞菌（Ae化/〇曲口打<36·巧7.)菌株ADP的別^八 来自酿酒酵母的DUR1，2、来自解脂耶氏酵母化IB122的YALI0E07271g、来自假单胞菌菌株 ADP的別如'、来自假单胞菌菌株ADP的a化来自假单胞菌菌株NRRLB-12227的irz化来自 红球菌Mel的a化来自红球菌Mel的irz化来自大肠杆菌K12菌株MG1566的巧Λ3化来自大 豆慢生根瘤菌（《巧々^分?打〇如心曲知/7〇/7如歴）1]504110的61^880、来自酿酒酵母的6抓1/ Y DL238C、来自解脂耶氏酵母CLIB122的YAL10E2 5740p、来自威廉姆斯氏菌（於 sp.) NRRL B-15444R的皆来自假单胞菌菌株NRRL B-12227的iriA来自假单胞菌菌株 ADP的a?乂郝来自痛抱漆斑菌（你roiAeci"曲caA。
[0095] 在某些实施方案中，本发明设及分离的核酸分子，其包含任一个本文公开的序列。 在某些实施方案中，本发明设及分离的核酸分子，其与任一个本文公开的序列具有至少85% 序列同源性。在某些实施方案中，本发明设及分离的核酸分子，其与任一个本文公开的序列 具有至少90%序列同源性。在某些实施方案中，本发明设及分离的核酸分子，其与任一个本 文公开的序列具有至少95%序列同源性。在某些实施方案中，本发明设及分离的核酸分子， 其与任一个本文公开的序列具有至少99%序列同源性。在某些实施方案中，本发明设及分 离的核酸分子，其具有任一个本文公开的序列。
[0096] 重组载体，包含与启动子操作性连接的上述任一个核酸分子。
[0097] 在某些实施方案中，本发明设及重组载体，其包含任一个本文公开的序列。在某 些实施方案中，本发明设及重组载体，其与任一个本文公开的序列具有至少85%序列同源 性。在某些实施方案中，本发明设及重组载体，其与任一个本文公开的序列具有至少90%序 列同源性。在某些实施方案中，本发明设及重组载体，其与任一个本文公开的序列具有至少 95%序列同源性。在某些实施方案中，本发明设及重组载体，其与任一个本文公开的序列具 有至少99%序列同源性。
[0098] 本发巧的示例件的绕某闲工括改推的牛物体 在某些实施方案中，本发明设及经基因工程改造的生物体，其中所述经基因工程改造 的生物体已被包含任一个本文公开的序列的核酸分子或重组载体转化。在某些实施方案 中，所述核酸分子或重组载体与任一个本文公开的序列具有至少85%序列同源性。在某些 实施方案中，所述核酸分子或重组载体与任一个本文公开的序列具有至少90%序列同源 性。在某些实施方案中，所述核酸分子或重组载体与任一个本文公开的序列具有至少95% 序列同源性。在某些实施方案中，所述核酸分子或重组载体与任一个本文公开的序列具有 至少99%序列同源性。在某些实施方案中，本发明设及经基因工程改造的生物体，其中所述 经基因工程改造的生物体已被具有任一个本文公开的序列的核酸分子或重组载体转化。
[0099] 在某些实施方案中，本发明设及经基因工程改造的生物体，其中所述经基因工程 改造的生物体已被核酸分子转化；所述核酸分子包含非天然基因；和所述非天然基因编码 选自W下的非天然酶：脈基甲酸水解酶、双缩脈酷胺水解酶、Ξ聚氯酸酷胺水解酶、鸟嚷岭 脱氨酶、Ξ聚氯酸二酷胺水解酶、Ξ聚氯酸一酷胺水解酶、Ξ聚氯胺脱氨酶和异丙基Ξ聚氯 酸一酷胺异丙基氨基水解酶、氨腊水合酶、脈酶或脈簇化酶。
[0100] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述经基因工程改造的生物体，其中所述 非天然基因选自別^八〇抓1,2、￥4]^10607271邑、別如'、別。义皆乂"、皆^化皆如'、別。义巧/<3化blr3880、GUDl/Y DL238C、YAL10E2 5740p、iriA別^巧0caA。在某些实施方案中， 本发明设及任一种上述经基因工程改造的生物体，其中所述非天然基因选自ai^KDURl，2、 YALI0E 07271g、別^公、化化化化blr3880、GUD1/Y DL238C、YAL10E2 5740p、 iriAai乂郝caA。任何生物体可用作非天然基因的来源，只要该生物体具有所需的 酶活性。所述非天然基因各自可得自任一种上述微生物的染色体DNA，即通过分离与缺乏 酶活性的不同菌株的营养缺陷型互补的DNA片段。或者，如果生物体的运些基因的核巧酸 序列已经被阐明度iochemistry,第 22 卷，第 5243-5249 页，1983J.Biochem.第 95 卷，第 909-916 页，1984 ;Gene,第 27 卷，第 193-199 页，1984 ;Mic;robiology,第 140 卷，第 1817-1828 页，1994 ;Mol.GeneGenet.第 218 卷，第 330-339 页，1989; 和MolecularMicrobiology,第6卷，第317-326页，1992)，可通过PCR，使用根据各个 已阐明的核巧酸序列而合成的引物，并使用染色体DNA为模板，得到基因。
[0101] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述经基因工程改造的生物体，其中所述 非天然基因选自来自红球菌菌株Mel的ir如、来自魏豆根瘤菌的ir如、皆乂"MEL皆乂" 12227、来自尖抱镶刀菌化5176的caA、来自化/c併'awinaear歴CS3096的caA、来自 玉米赤霉PH-1的caA、来自白曲霉IF0 4308的caA、来自黑曲霉CBS513. 88的caA、来自 黑曲霉ATCC1015的caA、来自米曲霉3. 042的caA、来自酿酒酵母化stersB的caA、来自 假单胞菌菌株ADP的八来自酿酒酵母的DUR1，2、来自解脂耶氏酵母化IB122的YALI0E 07271g、来自假单胞菌菌株ADP的来自假单胞菌菌株ADP的aizA来自假单胞菌菌株 NRRLB-12227的irz化来自红球菌Mel的ate化来自红球菌Mel的irz化来自大肠杆菌K12 菌株MG1566的巧Λ3化来自大豆慢生根瘤菌USDA110的blr3880、来自酿酒酵母的GUD1/Y DL238C、来自解脂耶氏酵母CLIB122的YAL10E2 5740p、来自威廉姆斯氏菌NRRLB-15444R 的来自假单胞菌菌株NRRLB-12227的iriA来自假单胞菌菌株ADP的3(^巧日来自 痛抱漆斑菌的caA。
[0102] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述经基因工程改造的生物体，其 中所述经基因工程改造的生物体是W下属的物种：耶氏酵母属（/arroria)、酵母属 (5'<3<：^口山/'(9曲八6'5)、化<3紅6<3、毕赤酵母属（巧〇/?站）或埃希氏菌属（仿〇/?6'_/'/〇/?站)。
[0103] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述经基因工程改造的生物体，其中 所述经基因工程改造的生物体选自解脂耶氏酵母（/ariwia7攻〇如。心、酿酒酵母 {Saccharomycescerevisiae)、0gataeapolymorpha、四孰噫'毕养轉巧{Pichiapastoris) 和大肠杆菌（仿cAericAiacoii)。
[0104] 在某些实施方案中，所述经基因工程改造的生物体不是红球菌菌株Mel。 。…引本发巧的示例忡方法 在某些实施方案中，本发明设及方法，包括W下步骤： 使任一种上述经基因工程改造的生物体接触底物， 其中 所述底物包含含氮部分和不含氮部分； 所述含氮部分包含约10%重量至约100%重量的量的式Ι-ΠΙ的任一个的含氮化合物； 与所述经基因工程改造的生物体相同物种的天然生