物体不能代谢（即用作氮源）所述 含氮化合物；和 所述经基因工程改造的生物体将底物转化为产物。
[0106] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮化合物具有低分 子量。在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮化合物的分子量介于 约30化和约800Da之间。在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮化 合物的分子量介于约40化和约600化之间。在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方 法，其中所述含氮化合物的分子量为约40化、约50化、约60化、约70化、约80化、约90化、约 lOODa、约llODa、约 120Da、约 130Da、约 140Da、约 150Da、约 160Da、约 170Da、约 180 Da、约190Da、约200Da、约220Da、约240Da、约260Da、约280Da、约300Da、约320Da、 约 340Da、约 360Da、约 380Da、约 400Da、约 420Da、约 440Da、约 460Da、约 480Da、约 500Da、约 520Da、约 540Da、约 560Da、约 580Da或约 600Da。
[0107]在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮化合物具有小于 12个碳原子。在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮化合物具有小 于8个碳原子。在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮化合物具有 1、 2、3、4、5、6或7个碳原子。
[010引在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮化合物具有1、2、 3、4、5、6、7、8、9 或 10 个氮原子。
[0109] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮化合物具有0、1、 2、 3、4、5、6、7或8个氧原子。
[0110] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮化合物的辛 醇-水分配系数（1〇评）为小于约5。在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中 所述含氮化合物的辛醇-水分配系数（1〇评）为约-0.5至约5。在某些实施方案中，本发明 设及任一种上述方法，其中所述含氮化合物的辛醇-水分配系数（log巧为约-0.5、约0、 约0. 5、约1、约1. 5、约2、约2. 5、约3、约3. 5、约4或约4. 5。
[0111] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮化合物在约20°c 可溶于水，浓度介于约O.Olg/L至约lOOOg/L之间。在某些实施方案中，本发明设及任一 种上述方法，其中所述含氮化合物在约20°C可溶于水，浓度为约0. 01邑/1、约0. 05邑/1、约 0.Ig/l、约 0. 5g/l、约Ig/l、约 5g/l、约lOg/l、约 15g/l、约 20g/l、约 25g/l、约 30g/l、约 35邑/1、约 40g/l、约 45g/l、约 50g/l、约 55g/l、约 60g/l、约 65g/l、约 70g/l、约 75g/l、约 80邑/1、约 85旨/1、约 90旨/1、约 95g/L或约lOOg/L。
[0112] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮化合物通过被动 运输穿过细胞膜移动。被动运输包括扩散、促进扩散和过滤。
[0113] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮化合物通过主动 运输穿过细胞膜移动，例如，经由ATP-结合盒（ABC)转运蛋白或其它已知跨膜转运蛋白。
[0114] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮化合物通过细胞 膜运输。
[0115] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮化合物基本上是 非杀生物剂。
[0116] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮化合物基本上是 可生物降解的。
[0117] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮部分包含约10%、 约 15%、约 20%、约 25%、约 30%、约 35%、约 40%、约 45%、约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约 70〇/〇、 约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%重量的含氮化合物。
[0118]在某些实施方案中，本发明设及方法，包括W下步骤： 使任一种上述经基因工程改造的生物体接触底物， 其中 所述底物包含含氮部分和不含氮部分； 所述含氮部分包含约10%重量至约100%重量的量的选自W下的含氮化合物：Ξ嗦、脈、Ξ聚氯胺、氨腊、2-氯基脈、Ξ聚氯酸二酷胺、碳酸脈、乙二胺、Ξ聚氯酸一酷胺、双缩脈、二 亚乙基Ξ胺、Ξ亚乙基四胺、1,3-二氨基丙烷、氯氨化巧、Ξ聚氯酸、氨基乙基赃嗦、赃嗦和 脈基甲酸讯 所述经基因工程改造的生物体将底物转化为产物。
[0119]在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述含氮部分包含约10%、 约 15%、约 20%、约 25%、约 30%、约 35%、约 40%、约 45%、约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约 70〇/〇、 约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%重量的含氮化合物。
[0120] 在某些实施方案中，本发明设及方法，包括W下步骤： 使任一种上述经基因工程改造的生物体接触底物， 其中 所述底物包含含氮部分和不含氮部分； 所述含氮部分基本上由选自W下的含氮化合物组成嗦、脈、Ξ聚氯胺、氨腊、2-氯 基脈、Ξ聚氯酸二酷胺、碳酸脈、乙二胺、Ξ聚氯酸一酷胺、双缩脈、二亚乙基Ξ胺、Ξ亚乙基 四胺、1，3-二氨基丙烷、氯氨化巧、Ξ聚氯酸、氨基乙基赃嗦、赃嗦和脈基甲酸；和 所述经基因工程改造的生物体将底物转化为产物。
[0121] 在某些实施方案中，本发明设及方法，包括W下步骤： 使任一种上述经基因工程改造的生物体接触底物， 其中 所述底物由含氮部分和不含氮部分组成； 所述含氮部分由选自W下的含氮化合物组成嗦、脈、Ξ聚氯胺、氨腊、2-氯基脈、Ξ聚氯酸二酷胺、碳酸脈、乙二胺、Ξ聚氯酸一酷胺、双缩脈、二亚乙基Ξ胺、Ξ亚乙基四胺、 1，3-二氨基丙烷、氯氨化巧、Ξ聚氯酸、氨基乙基赃嗦、赃嗦和脈基甲酸；和 所述经基因工程改造的生物体将底物转化为产物。
[0122]在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述经基因工程改造的生 物体将产物隔离（sequester)。
[0123]在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中使用多种经基因工程改造 的生物体。
[0124]在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述底物不包含抗生素。
[0125]在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述底物不包含硫酸锭。
[0126]在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述底物不包含脈。
[0127]在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中非经基因工程改造的生物 体，即天然生物体，不能代谢（即用作氮源）所述含氮化合物。在某些实施方案中，所述经 基因工程改造的生物体不是红球菌菌株Mel。
[0128]在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述底物包含木质纤维素 材料、葡萄糖、木糖、薦糖、乙酸、甲酸、乳酸、τ酸、游离脂肪酸、右旋糖、甘油、果糖、乳糖、半 乳糖、甘露糖、鼠李糖或阿拉伯糖、或其组合。
[0129] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中底物抑为约2. 5至约10。
[0130] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中在约15°C至约80°C的溫度 下使经基因工程改造的生物体接触底物。
[0131] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中使经基因工程改造的生物 体在约化至约lOd的时间期限内接触底物。
[0132] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中使经基因工程改造的生物 体在发酵罐中接触底物。
[0133] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中使经基因工程改造的生物 体在工业规模的发酵罐中接触底物。
[0134] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中使多种经基因工程改造的 生物体在多个发酵罐中接触多种底物，其中多个发酵罐平行排列。
[0135] 在某些实施方案中，本发明设及任一种上述方法，其中所述产物是乙醇、异丙醇、 乳酸、异戊二締类、脂质、高价值的专业化学品、下醇、1,3-丙二醇、1,4-下二醇、班巧酸、所 表达的蛋白产物、酶产物、多元醇、药物产品、衣康酸、或高价值的专业化学品。 阳13引示例件的产物 在某些实施方案中，本发明设及通过任一种上述方法制备的产物。 实施例
[0137]提供W下实施例W举例说明本发明。然而，应当理解，各实施例中给出的具体细节 已被选择用于说明性目的，而不应视为限制本发明的范围。通常，在类似条件下进行实验， 除非有说明。
[013引连施例1 油质酵母解脂耶氏酵母可经工程改造W将Ξ聚氯胺转化为氨。Ξ聚氯胺（CsNeHe)是高 度含氮的化合物，其仅可被非常有限数量的生物体包括红球菌菌株Mel降解。将Ξ聚氯胺 降解途径并入耶氏酵母，同时改良培养基组成W利用Ξ聚氯胺作为主要氮源，将产生更稳 健的工业生产解决方案，其可用于多种应用。经运种改良所证实的优势是明显的，足W在多 种应用中提供优势，包括在其中核屯、技术可能对生物体有明显遗传负担的情况下。
[013引连施例2 将图3的基因，或合适的同源物克隆入宿主菌株例如解脂耶氏酵母、酿酒酵母或大肠 杆菌。宿主生物体的天然酶，例如脈基甲酸水解酶或鸟嚷岭脱氨酶可W用异源启动子过量 表达。通过酶活性和赋予合适的途径中间体氮限制性生长的能力，测定功能性表达。最终， 选择能够降解Ξ聚氯胺的菌株，用于改善经由Ξ聚氯胺限制性连续培养的途径利用或其它 选择方法。对于图2所列举的氮化合物，可W设计类似策略。 阳140]连施例3-经由薛母介导的连按的裁化构律基础载体 载体pNClO含有大肠杆菌pMBl复制起点和氨节青霉素抗性基因、酿酒酵母2化复制起 点和URA3基因、W及含有对于化clJmel和AscI的8-bp识别序列的多个克隆位点。经由酵 母介导的同源重组（YML)克隆，将目标DM插入多个克隆位点（化anks等人，2006 ;化anks等人，2009)。简而言之，通过PCR，使用具有与最终载体中的临近DM区段同源的20-40bp 突出端的引物，扩增祀DM序列。然后限制性消化pNClO或另一合适的基础载体，产生线性 质粒。将PCR产物和线性质粒转化到酿酒酵母中，天然酿酒酵母缺口修复机制根据同源突 出端而装配完整质粒。
[0141] 然后可经由DNA提取方案，从酿酒酵母中分离完整载体并用于转化大肠杆菌。再 经由DNA质粒mini-prep或其它合适的标准分子生物学方案，从大肠杆菌中回收浓缩的载 体。参见图5。 阳14引 戚藏姨/4 -酿酒酵母教娩 5mL酿酒酵母ura3营养缺陷型菌株的培养物在YPD中在30°C培养过夜。
[0143] 将1. 5血过夜培养物转移至50血新鲜YPD中（0D~ 0. 3)并在30°C在烧瓶中 于200巧m振摇。让其生长约4-5小时，直至0D为1. 0。
[0144] 在巧,000巧m将细胞离屯、1min,重悬于50血无菌水并重复。
[014引将1血100ml乙酸裡加入细胞沉淀物中并将细胞转移至1.5血管。
[0146] 在〉12,000巧m将细胞离屯、10秒，去除上清液，并重悬于400 - 800化100ml LiAc(每次转化使用50化该细胞悬液）。
[0147] 每份样品制备如下的转化母液混合物
每次转化制备一个1.5血管。每管加入：5化已消化的载体、5化各PCR插入物（假 设良好PCR扩增，约100-200ngDNA)，加水至最终体积34化。加入326化母液混合物， 再加入50化细胞悬液。满旋震荡管W完全混合内容物。
[014引在30°C解育30min,然后通过上下翻转而混合，再放入42°C水浴30min。（注意 在42°C的最佳时间，各菌株不同）。
[0149]在〉12,000巧m将细胞离屯、10秒，去除阳G混合物并重悬于1血无菌水。再次 离屯、细胞，去除800化，并使用最终200化重悬并涂布于SD-URA板。在30°C解育2-4天。 阳150] 连施例5 -Ξ聚氯胺同化酶在酿酒酵母中的表武 通过使用上述的酵母介导的连接而构建载体，可将Ξ聚氯胺同化基因或它们的亚组在 酿酒酵母中表达。表达载体由W下组成：酿酒酵母功能性启动子、Ξ聚氯胺同化途径的酶的 编码基因、和酿酒酵母功能性终止子。启动子-基因-终止子基序的装配可W并入单个菌 株中，在复制的质粒上或者整合到染色体中。可能的启动子和终止子列举如下，另见Sun等 人，2012。在解脂耶氏酵母TEF1启动子和终止子控制之下表达聚氯胺水合酶的代 表性的质粒，示于W下。
[0151]质粒AJS35是经由解脂耶氏酵母TEF1启动子和终止子转录的Ξ聚氯胺脱水酶 的实例。参见图6。
[0152] 菌株NS98和NS99是工业用酿酒酵母菌株，其分别携带质粒pNC96OiygK，和来自 红球菌Μ化的经密码子优化的，和PNC97OiygK，和来自魏豆根瘤菌的经密码子优化 的。菌株NS100是相同的工业用酿酒酵母菌株，其携带质粒pNC67 (hygK,nat")，所 述菌株用作对照菌株。
[0153] 在30°C，将菌株NS98、NS99和NS100在含有10ml脈和100μκ/ιΛ潮霉素的限定 ΥΝ