>[018引序列13是假单胞菌菌株NRRL B-12227 ( W前称为西瓜食酸菌）的Ξ聚氯胺脱氨 酶基因的DNA序列。
[0189] 序列14是假单胞菌菌株ADP的异丙基Ξ聚氯酸一酷胺异丙基氨基-水解酶 基因的DM序列。
[0190] 序列15是痛抱漆斑菌氨腊水合酶（心旬基因的cDNA序列。
[01W]序列16-21是本发明的DM序列。
[0192] 序列22-37是用于本发明的不同氨腊水合酶（心旬基因的序列。
[0193] 序列38和39是用于本发明的不同基因的序列。
[0194] 序列40和41是用于本发明的不同ir逆基因的序列。
[019引序列42是质粒pNClO的序列。
[0196] 序列43是质私;pNC53的序列。
[0197] 序列44是质粒PNC67的序列。
[0198] 序列45是质私;pNC85的序列。
[0199] 序列46是质粒PNC86的序列。
[0200] 序列47是质私;pNC87的序列。
[020。序列48是质粒PNC93的序列。
[020引序列49是质粒pNC96的序列。
[020引序列50是质粒PNC97的序列。
[0204] 序列51是质私;pNClOl的序列。
[020引序列52是质粒PNC120的序列。
[020引序列53是质私;pNC121的序列。
[0207] 通过引用结合 本文引用的所有美国专利和美国公布的专利申请都通过引用结合到本文中。
[020引等同方案 本领域技术人员将会知道，或仅使用常规实验能够确定，本文描述的本发明的具体实 施方案的许多等同方案。运样的等同方案意图包括在所附权利要求书中。
【主权项】
1. 经基因工程改造的生物体，其中所述经基因工程改造的生物体已被核酸分子转化， 所述核酸分子包含任一个本文公开的序列。2. 经基因工程改造的生物体，其中所述经基因工程改造的生物体已被核酸分子转化； 所述核酸分子包含非天然基因；和所述非天然基因编码选自以下的非天然酶：脲基甲酸水 解酶、双缩脲酰胺水解酶、三聚氰酸酰胺水解酶、鸟嘌呤脱氨酶、三聚氰酸二酰胺水解酶、三 聚氰酸一酰胺水解酶、三聚氰胺脱氨酶、异丙基三聚氰酸一酰胺异丙基氨基水解酶、氨腈水 合酶、脲酶和脲羧化酶。3. 权利要求2的经基因工程改造的生物体，其中所述非天然基因选自aDUR1，2、 YALIOE07271g^atzE, atzD, trzC, trzD, trzE, guaD,blr3880^GUD1/YDL238C^YAL10E2 5740p、a口cah。4. 权利要求2的经基因工程改造的生物体，其中所述非天然基因选自选自来自红球 菌6·/λ)菌株Mel的 来自碗豆根瘤菌（TPAizoAi· 的 i_rzCMEL、12227、来自尖抱镜刀菌Fo5176 的caA、 来自 /7. CS3096 的caA、来自玉米赤霉zeae)PH-1 的 caA、来自白曲霉 々aracAii)IFO4308 的caA、来自黑曲霉 〇4. 供'_r)CBS 513. 88的caA、来自黑曲霉ATCC1015的caA、来自米曲霉（Aoiyzae) 3. 042的caA、来 自酿酒酵母（51cereKisiae)FostersB的caA、来自假单胞菌职）菌 株ADP的ato尸、来自酿酒酵母的DUR1，2、来自解脂耶氏酵母（ZCLIB122的 ￥八1^(^ 072718、来自假单胞菌菌株40?的(^^、来自假单胞菌菌株40?的(3匕从来自假单 胞菌菌株NRRLB-12227的来自红球菌Mel的a?ζΛ来自红球菌Mel的来自大 肠杆菌Κ12菌株MG1566的仲<3从来自大豆慢生根瘤菌CSraoyrAizoAi-JajOawiciM?)USDA 110的blr3880、来自酿酒酵母的GUD1/YDL238C、来自解脂耶氏酵母CLIB122的YAL10E2 5740p、来自威廉姆斯氏菌（FiWia/asiasp.)NRRLB-15444R的irzA来自假单胞菌菌株 NRRLB-12227的iriA来自假单胞菌菌株ADP的来自疏孢漆斑菌（ifyroiAeciiM? verrucaria)|3tlcah〇5. 权利要求1-4中任一项的经基因工程改造的生物体，其中所述经基因工程改造的生 物体是以下属的物种：耶氏酵母属（/amia)、酵母属（5'<31^^3/^_^6>6 1)、6^3^(36>(3、毕赤酵 母属（/YcAia)或埃希氏菌属（fccAericAia)。6. 权利要求1-4中任一项的经基因工程改造的生物体，其中所述经基因工程改 造的生物体选自解脂耶氏酵母（/amia 、酿酒酵母 cereKisiae)、（^aiaea 巴斯德毕赤酵母（/YcAiajOasiori·?)和大肠杆菌 {Escherichia coif)。7. 方法，包括以下步骤： 使权利要求1-6中任一项的经基因工程改造的生物体接触底物， 其中 所述底物包含含氮部分和不含氮部分； 所述含氮部分包含约10%重量至约100%重量的量的式Ι-ΠΙ的任一个的含氮化合物 或其盐； 与所述经基因工程改造的生物体相同物种的天然生物体不能代谢（即，用作氮源）所 述含氮化合物； 所述经基因工程改造的生物体将底物转化为产物；和式I化合物是 其中，每次出现时独立地， 是5-、6-、9-或10-元芳基或杂芳基； R是-OH、-C02H、-N02、-CN、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的烷基；和 η是 0、1、2、3、4 或 5 ; 式II化合物是 II其中，每次出现时独立地， X是-ΝΗ-、-Ν(烷基）-、-0-、-C(R1) 2-、或不存在； Y是-H、-NH2、-N(H)(烷基）、-N(烷基）2、-C02H、-CN或取代的或未取代的烷基；和 R1是-H、-OH、-CO2H、-N02、-CN、取代的或未取代的氨基、或取代的或未取代的烷基；和 式III化合物是 III其中，每次出现时独立地， Y是-H、-NH2、-N(H)(烷基）、-N(烷基）2、-C02H、-CN或取代的或未取代的烷基。8.方法，包括以下步骤： 使权利要求1-6中任一项的经基因工程改造的生物体接触底物， 其中 所述底物包含含氮部分和不含氮部分； 所述含氮部分包含约10%重量至约100%重量的量的选自以下的含氮化合物：肼、5-氨 基四唑、四唑、三聚氰胺、氨腈、2-氰基胍、叠氮化钠、碳酰肼、1，2, 3-三唑、1，2, 4-三唑、 1，3-二氨基胍HC1、三聚氰酸二酰胺、1，3, 5-三嗪、氨基乙腈、氰基乙肼、偶氮二甲酰胺、联 二脲、氨基甲肟、1，2-二甲肼、1，1-二甲肼、乙肼、乙二胺、双氰胺钠、碳酸胍、甲胺、三聚氰 酸一酰胺、羟胺、丙二腈、双缩脲、二乙基三胺、六亚甲基四胺、三亚乙基四胺、1，3-二氨基丙 烷、三亚乙基四胺、1，3-二氨基丙烷、羟基脲、四亚乙基五胺、硫脲、琥珀腈、氰氨化钙、三聚 氰酸、氨基乙基哌嗪、哌嗪、二甲胺、乙胺、达伐吡啶、四硝基甲烷、咪唑烷基脲、三硝基甲烷、 丙二酰胺、氯胺、脲基甲酸、三甲胺、硝基甲烧、乙醛月亏、双咪唑烷基脲、1，2-环己二酮二肟、 丙酮肟、硫代乙酰胺、硫氰酸钠、异噻唑、噻唑、二甲基乙酰胺、异噻唑啉酮、亚甲蓝、二乙醇 胺、天冬甜素、苯并异噻唑啉酮和乙酰氨基磺酸钾；和 所述经基因工程改造的生物体将底物转化为产物。9. 方法，包括以下步骤： 使权利要求1-6中任一项的经基因工程改造的生物体接触底物， 其中 所述底物包含含氮部分和不含氮部分； 所述含氮部分基本上由选自以下的含氮化合物组成：肼、5-氨基四唑、四唑、三聚氰 胺、氨腈、2-氰基胍、叠氮化钠、碳酰肼、1，2, 3-三唑、1，2, 4-三唑、1，3-二氨基胍HC1、三聚 氰酸二酰胺、1，3, 5-三嗪、氨基乙腈、氰基乙肼、偶氮二甲酰胺、联二脲、氨基甲肟、1，2-二 甲肼、1，1-二甲肼、乙肼、乙二胺、双氰胺钠、碳酸胍、甲胺、三聚氰酸一酰胺、羟胺、丙二 腈、双缩脲、二乙基三胺、六亚甲基四胺、三亚乙基四胺、1，3-二氨基丙烷、三亚乙基四胺、 1，3-二氨基丙烷、羟基脲、四亚乙基五胺、硫脲、琥珀腈、氰氨化钙、三聚氰酸、氨基乙基哌 嗪、哌嗪、二甲胺、乙胺、达伐吡啶、四硝基甲烧、咪唑烷基脲、三硝基甲烧、丙二酰胺、氯胺、 脲基甲酸、三甲胺、硝基甲烧、乙醛月亏、双咪唑烷基脲、1，2-环己二酮二肟、丙酮月亏、硫代乙酰 胺、硫氰酸钠、异噻唑、噻唑、二甲基乙酰胺、异噻唑啉酮、亚甲蓝、二乙醇胺、天冬甜素、苯并 异噻唑啉酮和乙酰氨基磺酸钾；和 所述经基因工程改造的生物体将底物转化为产物。10. 方法，包括以下步骤： 使权利要求1-6中任一项的经基因工程改造的生物体接触底物， 其中 所述底物由含氮部分和不含氮部分组成； 所述含氮部分由选自以下的含氮化合物组成：肼、5-氨基四唑、四唑、三聚氰胺、氨腈、 2_氰基胍、叠氮化钠、碳酰肼、1，2, 3-三唑、1，2, 4-三唑、1，3-二氨基胍HC1、三聚氰酸二 酰胺、1，3, 5-三嗪、氨基乙腈、氰基乙肼、偶氮二甲酰胺、联二脲、氨基甲肟、1，2-二甲肼、 1，1-二甲肼、乙肼、乙二胺、双氰胺钠、碳酸胍、甲胺、三聚氰酸一酰胺、羟胺、丙二腈、双缩 脲、二乙基三胺、六亚甲基四胺、三亚乙基四胺、1，3-二氨基丙烷、三亚乙基四胺、1，3-二氨 基丙烷、羟基脲、四亚乙基五胺、硫脲、琥珀腈、氰氨化钙、三聚氰酸、氨基乙基哌嗪、哌嗪、二 甲胺、乙胺、达伐吡啶、四硝基甲烷、咪唑烷基脲、三硝基甲烷、丙二酰胺、氯胺、脲基甲酸、三 甲胺、硝基甲烷、乙醛肟、双咪唑烷基脲、1，2-环己二酮二肟、丙酮肟、硫代乙酰胺、硫氰酸 钠、异噻唑、噻唑、二甲基乙酰胺、异噻唑啉酮、亚甲蓝、二乙醇胺、天冬甜素、苯并异噻唑啉 酮和乙酰氨基磺酸钾；和 所述经基因工程改造的生物体将底物转化为产物。11. 权利要求7-10中任一项的方法，其中使用多种经基因工程改造的生物体。12. 权利要求7-11中任一项的方法，其中所述底物不包含抗生素。13. 权利要求7-12中任一项的方法，其中所述底物不包含硫酸铵。14. 权利要求7-13中任一项的方法，其中所述底物不包含脲。15. 权利要求7-14中任一项的方法，其中非经基因工程改造的生物体，即天然生物体， 不能代谢（即用作氮源）所述含氮化合物。16. 权利要求7-15中任一项的方法，其中所述底物包含木质纤维素材料、葡萄糖、木 糖、蔗糖、乙酸、甲酸、乳酸、丁酸、游离脂肪酸、右旋糖、甘油、果糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、鼠 李糖或阿拉伯糖、或其组合。17. 权利要求7-16中任一项的方法，其中底物pH为约2. 5至约10。18. 权利要求7-17中任一项的方法，其中在约15°C至约80°C的温度下使经基因工程改 造的生物体接触底物。19.权利要求7-18中任一项的方法，其中使经基因工程改造的生物体在约6h至约10d 的时间期限内接触底物。20. 权利要求7-19中任一项的方法，其中使经基因工程改造的生物体在发酵罐中接触 底物。21. 权利要求7-20中任一项的方法，其中使经基因工程改造的生物体在工业规模的发 酵罐中接触底物。22. 权利要求7-21中任一项的方法，其中使多种经基因工程改造的生物体在多个发酵 罐中接触多种底物，其中多个发酵罐平行排列。23. 权利要求7-22中任一项的方法，其中所述产物是乙醇、乳酸、异戊二烯类、脂质、高 价值的专业化学品、丁醇、异丙醇、3-羟基丙酸、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、琥珀酸、表达的 蛋白产物、酶产物、多元醇、药物产品或衣康酸。24. 通过权利要求7-23中任一项的方法制备的产物。25. 包含与启动子操作性连接的基因的重组载体，其中所述基因编码酶；和所述酶是 脲基甲酸水解酶、双缩脲酰胺水解酶、三聚氰酸酰胺水解酶、鸟嘌呤脱氨酶、三聚氰胺脱氨 酶、异丙基三聚氰酸一酰胺异丙基氨基水解酶、氨腈水合酶、脲酶或脲羧化酶。26.权利要求25的重组载体，其中所述基因选自来自假单胞菌菌株ADP的ato尸、来自 酿酒酵母的DUR1，2、来自解脂耶氏酵母CLIB122的YALI0E07271g、来自假单胞菌菌株ADP 的aiW、来自假单胞菌菌株ADP的ato从来自假单胞菌菌株NRRLB-12227的irzA来自红 球菌Mel的a?ζΛ来自红球菌Mel的来自大肠杆菌K12菌株MG1566的济/<3从来自大 豆慢生根瘤菌USDA110的blr3880、来自酿酒酵母的GUD1/YDL238C、来自解脂耶氏酵母 CLIB122的YAL10E2 5740p、来自威廉姆斯氏菌NRRLB-15444R的irzA来自假单胞菌菌株 NRRLB-12227的iriA来自假单胞菌菌株ADP的来自疏孢漆斑菌的caA。27. 权利要求25或26的重组载体，其中所述载体具有本文公开的序列。
【专利摘要】公开的是经基因工程改造的生物体，例如酵母和细菌，其具有代谢非典型的氮源例如三聚氰胺和氨腈的能力。还描述了使用经基因工程改造的生物体的发酵方法。本发明的方法对于包括日用品、精细化学品和药品在内的各种化合物的工业化生物生产而言是稳健的过程。
【IPC分类】C12N1/00, C12N15/74
【公开号】CN105264061
【申请号】CN201480012382
【发明人】C.R.索思, A.J.肖四世
【申请人】诺沃吉公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2014年1月6日
【公告号】CA2895838A1, EP2941481A2, US20160115492, WO2014107660A2, WO2014107660A3