用的组合物均为分析纯级别的组合物，且可从Sigma购获得。
[0053]实施例1诱导成纤錐细胞转分化为PV神经元
[0054]具体实验流程:
[0055]I)腺病毒载体构建:将Ascll基因通过BamHI+EcoRI双酶切构建到腺病毒pAD载体，分别进行病毒的包装和病毒滴度的测定；
[0056]2)小鼠成纤维细胞细胞的制备:选取14.5天的小鼠胚胎，去头、尾、脊柱、内脏和生殖腺后，取皮肤组织，用0.5%胰酶消化5分钟后，把消化后的皮肤成纤维细胞铺到10厘米培养皿中用DMEM加10%胎牛血清，进行培养，2天后传代一次，最终获得成纤维细胞；
[0057]3)病毒感染:将6万成纤维细胞铺到24孔板的一个孔，将包装好的Ascll腺病毒颗粒，感染成纤维细胞，6小时后，更换为神经元培养基(DMEM，1XB-27, 10 μ g/ml BDNF)，在神经元培养基中添加小化合物FSK (10 μ Μ)，之后两天更换一次培养基，诱导10后，检测成纤维细胞是否转分化神经元；
[0058]4) 10天培养后，将转分化细胞通过4%多聚甲醛固定，之后用5% BSA封闭，之后用兔的Tujl —抗孵育过夜,第二天用PBS洗3遍,然后用cy3链接的驴抗兔的二抗孵育I小时，之后在荧光显微镜下观测细胞形态和染色结果。
[0059]实验结果:
[0060]确定转分化形成的神经元的数目和形态。如TujiUPV等神经元标记的检测，结果见图1和图2，其中图1为本发明获得的神经细胞；A图为感染的GFP细胞；B图为神经元特异抗体Tujl免疫组化染色；C图为感染GFP细胞与Tujl染色共标；“GFP”代表感染的成纤维细胞，“TujI ”代表转分化神经元的TujI抗体染色，“GFP/TujI ”绿色的感染细胞有多少转分化为神经元，表明本发明获得到神经元细胞表达神经元特异的标记Tu j I。
[0061]图2表明转分化神经细胞是PV神经元；其中，A图为PV神经元特异抗体PV免疫组化染色；B图为神经元特异抗体Tujl免疫组合染色；C图为PV与Tujl抗体染色共标；其中:“PV”代表PV神经元特异标记PV抗体染色，“Tujl”代表转分化神经元的Tujl抗体染色；表明本发明获得到神经元细胞表达PV神经元特异的标记PV(图2)。
[0062]实施例2移棺PV神经细朐治疗癫痫疾病
[0063]具体实验流程:
[0064]I)癫痫小鼠模型的建立。通过腹腔注射匹鲁卡品药物(280mg/kg)到6周大的成年C57小鼠中，注射药物2周后，诱导建立癫痫小鼠模型。本试验的小鼠一共分为3组，包括10只正常小鼠组，10只癫痫小鼠组，10只移植神经细胞到癫痫小鼠组。
[0065]2)移植神经细胞。通过立体定位及微量注射系统，移植5万神经细胞到小鼠脑中的海马区域。
[0066]具体小鼠海马定位:用定位针在前囟后2mm,矢状缝旁开2.5mm处定位一点，即为海马的平面位置，然后在此点上用钻孔针在颅骨上钻一小圆孔。
[0067]移植细胞:小鼠海马则位于该圆孔下2 _，操作仪器使注射器针头由小鼠脑钻孔处下降2_时完成注射到小鼠脑海马处。结果如图3所示，其中I处为移植细胞，2处为海马区DAPI染色；
[0068]3)行为学范式检测小鼠疾病恢复程度。通过旷场实验行为学范式检测小鼠的行为学改变。抓住小鼠尾根部三分之一处提起，轻轻放入旷场实验箱(50厘米X50厘米X50厘米)正中格，记录5分钟内小鼠在旷场盒内的运动轨迹。
[0069]实验结果:
[0070] 通过将神经元移植到癫痫小鼠海马区域，2个月后检测小鼠的行为学指标。通过旷场实验，我们观察到正常小鼠组，癫痫小鼠组，移植组分别在5分钟内运动距离为11，000，15,000,14000厘米；分别待在中心区域时间的比例为3.7%，9.1%,4.2% ;分别待在中心区域距离的比例为8.2 %，20.3 %，10.4 %，结果如图5所示，表明癫痫小鼠移植抑制性PV神经元后，旷场实验表明小鼠癫痫症状得到恢复其中^Control”代表正常对照组，"Epilepsy"代表癫痫小鼠组，“PV-HC”代表移植组。
[0071 ] 旷场实验显示癫痫组运动时间多，运动距离长，在检测盒子中间待的时间明显多，显示癫痫鼠具有高频的活动。但神经元移植后，移植组运动距离有一定程度减少，呆在中心区时间和距离，移植组得到明显的改善。
【主权项】
1.一种组合物，所述组合物用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞，所述组合物包括Ascll基因和FSK ； 优选地，所述神经元细胞为PV神经元细胞。2.如权利要求1所述的组合物的用途，所述组合物用于制备将成纤维细胞转分化为神经元细胞的试剂，优选地，所述神经元细胞为PV神经元细胞。3.一种用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞的培养基，其中，所述培养基含有FSK，所述FSK的浓度为5-130 μ Μ，优选10 μ M ; 优选地，将FSK溶于水，制备为一定浓度的储液，然后用于制备所述培养基，优选地，所述FSK储液的浓度为0.5Μ-1Μ ； 优选地，所述培养基由DMEM培养基、Β-27添加剂、脑源性神经营养因子(BDNF)和FSK组成； 其中，所述DMEM培养基、Β-27添加剂、脑源性神经营养因子(BDNF)和FSK的比例为每I升培养基中含有980毫升的DMEM培养基，20毫升50ΧΒ-27添加剂，10微升10 μ g/mlBDNF以及5-30微升IM的FSK储液。4.一种将成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法，所述方法包括以下步骤: 1)将Ascll基因导入成纤维细胞； 优选地，所述成纤维细胞为小鼠成纤维细胞； 优选地，所述成纤维细胞使用DMEM培养基加10%胎牛血清培养基培养； 优选地，所述Ascll基因使用腺病毒pAD载体导入成纤维细胞； 2)将已导入Ascll基因的成纤维细胞，使用如权利要求3所述的神经元培养基培养，得到神经元细胞； 优选地，所述方法还包括鉴定神经元细胞的步骤，优选地，所述鉴定神经元细胞的步骤通过免疫组化法来进行。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤I)是通过包括以下步骤的方法来实现的: a.腺病毒载体构建:将Ascll基因通过BamHI+EcoRI双酶切构建到腺病毒pAD载体； b.小鼠成纤维细胞细胞的制备:选取14.5天的小鼠胚胎，取皮肤组织，用0.5%胰酶消化，使用DMEM加10%胎牛血清培养消化后的皮肤成纤维细胞，2天后传代一次，得到成纤维细胞； c.病毒感染:使用步骤a构建的Ascll腺病毒颗粒，感染成纤维细胞，从而将Ascll基因导入成纤维细胞。6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤2)是通过包括以下步骤的方法来实现的: 在将Ascll基因导入成纤维细胞6小时后，使用如权利要求3所述的神经元培养基培养，之后每两天更换一次培养基，诱导10天后，得到神经元细胞。7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述鉴定神经元细胞的步骤是通过包括下述步骤的方法来实现的: 将得到的神经元细胞通过4%多聚甲醛固定，之后用5% BSA封闭，之后用兔的Tujl —抗孵育过夜，第二天用PBS洗3遍，然后用cy3链接的驴抗兔的二抗孵育I小时，在荧光显微镜下观测细胞形态和染色结果。8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法制备的神经元细胞。9.一种组合物，所述组合物包括如权利要求8所述的神经元细胞。10.如权利要求8所述的神经元细胞或如权利要求9所述的组合物在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的应用； 优选地，所述神经系统疾病为癫痫病。
【专利摘要】本发明提供用于将成纤维细胞转化为PV神经元的组合物，所述组合物含有Ascl1基因以及FSK中的一种或多种。本发明还提供了一种将成纤维细胞转化为神经元细胞的方法。本发明还提供了根据本发明的方法制备的神经元细胞。在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的应用。本发明还提供了根据本发明的方法制备的神经元细胞在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的应用。本发明通过试验证明，所述转分化技术可以高效获得PV神经元，移植后很好的治疗癫痫疾病，通过癫痫发作次数的降低，提高记忆力，从而为治疗癫痫及相关疾病的治疗开辟了新的途径。
【IPC分类】C12N5/0793, A61P25/08, A61P25/00, C12N5/10, A61K35/30, C12N15/861
【公开号】CN105331634
【申请号】CN201410389682
【发明人】焦建伟, 史子啸
【申请人】中国科学院动物研究所
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年8月8日