一种牙周膜干细胞成脂分化诱导液及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞诱导分化领域，尤其涉及一种牙周膜干细胞成脂分化诱导液及 方法。
【背景技术】
[0002] 牙周膜是牙根与牙槽骨之间的一层结缔组织，是重要的牙周支持组织，主要由成 纤维细胞、成牙骨质细胞和一些未分化的间充质细胞组成。正常情况下，牙周组织具有自身 的更新和修复能力，其修复活动是通过牙周膜细胞自我更新实现的。在疾病或在受到外界 刺激时，通过牙周膜中细胞的不断增殖和分化使组织再生。2004年Seo等从拔除的第三磨牙 牙周膜组织中分离得到牙周膜干细胞(PeriodontalLigamentSemCellsJDLSCs)。此外， 在拔牙后牙槽窝的内表面也有PDLSCs存在。近来，有人从成人牙周组织中得到了高度纯化 的TOLSCs克隆。
[0003] PDLSCs具有潜在多向分化的干细胞特性，它不仅可以分化为牙体牙周组织细胞， 还可以横向分化为其他谱系的细胞。生理状态下牙周膜中并没有脂肪组织，但是已有报道 显示在地塞米松和胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤等诱导下干细胞分化为脂肪细胞。脂肪细胞 作为美容修复软组织缺损具有可塑性强、可适应不同缺损形状的优势。目前已有国外学者 研究证明TOLSCs可以通过cAMP调节成功分化为脂肪细胞。贺慧霞等通过STR0-1免疫磁珠分 选系统筛选roLSCs，取磁珠分离的第2代TOLSCs，培养3天待细胞长到90 %汇合度后，换成脂 诱导液A(基础培养基A、100mmol·L-1吲哚美辛、250mmol·L-hBMXdmmg·L-1胰岛素、 lmmol·L-1地塞米松、20%FBS)诱导3天，然后换成脂诱导维持液B(基础培养基B、5mmg·L-1 胰岛素)诱导1天，按照3:1方案连续诱导21天，实验中96.54%的TOLSCs可分化诱导成脂肪 细胞，证明了PDLSCs高效的成脂诱导潜能，其可望成为美容修复软组织缺损的干细胞来源 (贺慧霞，刘洪臣，王东胜，等.牙周膜干细胞向脂肪细胞方向定向诱导分化实验[J]，华西口 腔医学杂志，2010,28(2): 203-207)。
[0004] 但现有技术中牙周膜干细胞成脂分化诱导的诱导液和方法还有待进一步改进。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供一种牙周膜干细胞成脂分化诱导液及方法。
[0006] 为了实现上述目的，采用如下技术方案：
[0007] -种牙周膜干细胞成脂分化诱导液，包含基础培养基、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (IBMX)、胰岛素、B引噪美辛、地塞米松、富血小板血浆(PRP)和胎牛血清(FBS)。
[0008] 优选地，所述牙周膜干细胞成脂分化诱导液中PRP的含量为1-lOv/v%。
[0009] 优选地，所述牙周膜干细胞成脂分化诱导液中PRP的含量为5v/v%。
[0010] 优选地，所述牙周膜干细胞成脂分化诱导液，由下述含量的下述组分组成： 0 ·ImmoL/LIBMX、10mg/L胰岛素、0 ·ImmoL/L吲哚美辛、lymoL/L地塞米松、5v/v%PRP、10v/ v%FBS，余量为基础培养基，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
[0011 ] 本发明使用的富血小板血衆(Platelet-richplasma，PRP)是通过二次离心法得 到的血小板浓缩物，来自自体血液，获取容易，对人体损伤小，不存在免疫排斥反应，富含多 种生长因子如血小板衍生因子、转化生长因子β、血管内皮生长因子等，不同浓度的PRP具有 促进干细胞的增殖、成骨和成脂分化等作用，在临床上具有良好的应用前景。
[00?2 ] 优选地，所述PRP通过以下方法制备：1 〇mL自体外周血于400g条件下离心1Omin，离 心结束后血样自上而下依次分为上清层、白色细胞层和红色细胞层，取红色细胞层上部1-2mm以及全部的上清层和白色细胞层，在400g条件下离心5min，离心结束后血样自上而下依 次分为上清层、白色细胞层和红色细胞层，取上清层和白色细胞层在1200g条件下离心 5min，离心结束后保留最下面2.5mL即为PRP。
[0013]更优选地，PRP在使用前需要进行活化，所述活化方法为:将PRP移入含氯化钙的促 凝管，4°C过夜后在800g条件下离心12min，取全部上清0.22μπι过滤，即得活化后的PRP。
[0014]-种牙周膜干细胞成脂分化诱导方法，使用上述成脂分化诱导液进行诱导。
[0015]优选地，所述牙周膜干细胞成脂分化诱导方法，包括以下步骤:牙周膜组织消化后 进行细胞培养，分选出STR0-1+PDLSCs进行培养，使用上述成脂分化诱导液对第2-5代 TOLSCs进行诱导。
[0016] 优选地，使用磁珠分选法分选出STRO-ΓPDLSCs。
[0017] 更进一步优选地，磁珠分选法为:将收集消化后培养的细胞与STR0-1单抗4°C孵育 lh，与磁珠在4°C孵育30min，在磁力设备作用下筛选出STRO-ΓPDLSCs。
[0018]优选地，所述牙周膜干细胞成脂分化诱导方法，包括以下步骤：
[0019] l)PDLSCs原代分离及传代：
[0020] 刮取牙齿根中下1/3段的牙周膜组织，剪成约为1mm3大小；加入适量胶原酶_ Dispase酶1:1混合消化液，37°C消化3〇-35min后，lOOOrpm离心5min，弃上清，加入适量PBS 重悬，lOOOrpm离心5min，弃上清，加入含体积分数10 %FBS的DMEM/F12培养基重悬细胞，调 整细胞密度至1Xl〇4cel1s/mL，2mL每孔接种于六孔板，于5 %C02、37°C条件下培养；
[0021] 待细胞长至汇合度80-90%，收集细胞，用磁珠分选法分选出STRO-ΓPDLSCs，用 含体积分数10%FBS的DMEM/F12培养基重悬细胞，调整细胞密度至lX104cells/mL，2mL每 孔接种于六孔板中，于5%C02、37°C条件下培养；
[0022] 待细胞长至汇合度80-90%，弃培养液，加入适量0.25m/v%胰蛋白酶溶液，消化1-3min，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含体积分数10 %FBS的DMEM/F12培养基终止 消化，收集细胞，l〇〇〇rpm离心5min，弃上清；用含体积分数10%FBS的DMEM/F12培养基重悬 细胞，调整细胞密度至5X104cells/mL，接种于培养皿中于5 %C02、37°C条件下进行传代培 养，每隔2-3天换液一次；
[0023] 2)PDLSCs成脂分化：
[0024]取第3代TOLSCs，按1X104cellS/mL密度接种于12孔培养板内，培养至汇合度达到 70-80%以上时，更换为上述成脂分化诱导液，每隔3天换液，连续诱导21天。
[0025]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0026] 1)本发明牙周膜干细胞成脂分化诱导液及方法，在常规的诱导培养液基础上添加 人外周血提取的PRP，有效提高了PDLSCs的脂肪化效率，能够成功实现对PDLSCs的成脂诱 导，证明了TOLSCs高效的成脂诱导潜能，为美容修复软组织缺损应用种子细胞提供多一种 选择。
[0027] 2)本发明采用的原材料是12-18岁青少年在进行牙齿正畸治疗时需要拔除的第三 磨牙，目前基本作为医疗废弃物而扔掉；而本发明用于分离培养PDLSCs，进行成脂诱导方 法，有效实现了医疗废弃物的再利用。
【附图说明】
[0028] 图1为PDLSCs细胞表面标志物表达的流式检测图。图A-图F分别为⑶146、⑶105、 CD73、HLA-DR、CD34和CD45的流式检测图。
[0029]图2为细胞形态图。其中，图2A、图2B和图2C分别为P0代、P1代和P3代100倍放大图。 [0030]图3为阴性对照组油红0染色的结果图。其中图3A和图3B分别为200倍和400倍放大 图。
[0031]图4为阳性对照组油红0染色的结果图。其中图4A和图4B分别为200倍和400倍放大 图。
[0032]图5为实验组1油红0染色的结果图。其中图5A和图5B分别为200倍和400倍放大图。 [0033]图6为实验组2油红0染色的结果图。其中图6A和图6B分别为200倍和400倍放大图。 [0034]图7为实验组3油红0染色的结果图。其中图7A和图7B分别为200倍和400倍放大图。 [0035]图8为效果实施例1中的诱导分化率结果图。
[0036] 图9为效果实施例2中PPARγ-2的表达检测结果图。
[0037] 图10为效果实施例2中LPL的表达检测结果图。
【具体实施方式】
[0038]为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中使 用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
[0039] 本发明使用的部分试剂或仪器来源如表1所示，未标明来源的试剂或仪器均为本 领域常规试剂或仪器，可以自市面购买得到。
[0040] 表1、本发明使用的部分试剂和仪器来源
[0041]
[0042] 实施例1
[0043] -种牙周膜干细胞成脂分化诱导液，包含下述含量的下述组分:0.1mm〇L/L IBMX、 10mg/L胰岛素、0 · ImmoL/L吲噪美辛、lymoL/L地塞米松、lv/v%PRP、10v/v%FBS，余量为 DMEM/F12培养基。
[0044] 本实施例中PRP通过以下方法制备:将与牙齿同一供者的外周血于超净台内把血 样转入15mL离心管，10mL每管，400g，离心lOmin。离心结束后血样自上而下分为三层:淡黄 色上清层、白色细胞层和红色细胞层。吸取全部上清层、白色细胞层及红色细胞层上部1-2mm，移入新15mL离心管，400g离心5min。离心结束后吸取上清层和白色细胞层，移入新15mL 离心管，1200g离心5min。离心结束后弃上清，保留最下面的2.5mL，即富血小板血浆。移入含 氯化钙的促凝管，4°C过夜后800g离心12min，吸取出促凝管内的全部上清，0.22μπι过滤，滤 液-20°C保存待用。当PRP与氯化钙和凝血酶混合后，生长因子即从血小板中的α颗粒释放出 来，再经离心过滤就可以得到活化的PRP。
[0045]使用上述成脂分化诱导液诱导牙周膜干细胞成脂分化的方法，包括以下步骤：
[0046] l)roLSCs原代分离及传代
[0047]取材:将12-18岁健康供者的因正畸需要拔除的第三磨牙，快速浸入含3倍双抗的4 °C预冷的PBS中备用。用含3倍双抗的PBS从牙根到牙冠的方向冲洗牙体，彻底清除血污，重 复3次。用手术刀片冠根单向刮取根中下1/3段的牙周膜组织，移入离心管，并用眼科剪将组 织块剪成约为1_ 3大小。
[0048]消化：向组织碎块中加入适量混合消化液，置37°C恒温摇床中消化30-35min，消化 结束后，lOOOrpm离心5min，弃上清，加入适量PBS重悬，lOOOrpm离心5min，弃上清;加入培养 基(含体积分数10%FBS的DMEM/F12培养基)重悬细胞，使其密度为1X104cells/mL，接种于 六孔板，每孔2mL，5 %⑶2培养箱37°C培养。所述混合消化液由3g/L胶原酶溶液和4g/L Dispase酶溶液按体积比1:1的比例混合而成。
[0049]纯化：待细胞长至汇合度80-90 %，收集细胞，用磁珠分选法纯化细胞；具体方法 为:将收集的细胞与STR0-1单抗4°C孵育lh，与磁珠在4°C孵育30min，在磁力设备作用下筛 选出STRO-ΓPDLSCs，加入培养基(