含体积分数10%FBS的DMEM/F12培养基)重悬细胞，调整 细胞密度为1X104cells/mL，2mL每孔接种于新的六孔板中，5%C02培养箱37°C培养。
[0050] PDLSCs鉴定：待细胞长至汇合度80-90%，收集细胞（约1X106个），加入3g/L 1^如1^-100浸泡20111丨11，？83洗3遍，10%山羊血清室温封闭211，分别滴加1:200稀释的 〇)146、〇)105、〇)73、!11^-01?、〇)34丄045抗体各5(^1，同时对照组滴加单纯？83 5(^1，4°(3处 理16h。次日室温放置30min，roS漂洗3遍，各组分别滴加1:500稀释的FITC标记二抗IgG，常 温避光孵育lh，PBS漂洗2遍，10 %福尔马林固定细胞，上机测定抗原的阳性率。
[0051 ] 流式细胞检测结果如图1所示，PDLSCs细胞表面标志物表达率如表2所示。由表2和 图1可知，克隆细胞表面抗原⑶146、⑶105、⑶73表达阳性，而HLA-DR、⑶34、CD45表达阴性， 说明本发明中得到的TOLSCs属来源于中胚层的间充质干细胞。
[0052]表2、H)LSCs细胞表面标志物表达率
[0054]传代：将已鉴定正确的PDLSCs进行传代培养，用吸管吸弃旧培养液，加入适量 0.25m/v%胰蛋白酶，消化l-3min，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含体积分数 10 %FBS的DMEM/F12培养基终止消化，收集细胞，lOOOrpm离心5min，弃上清。加入适量含体 积分数10 %FBS的DMEM/F12培养基，进行细胞计数，按5X104cel1s/mL密度接种于培养皿中 进行传代培养，5 %C02培养箱37°C培养，每隔2-3天换液一次。培养过程中观察细胞形态，结 果如图2所示。细胞接种约4h后开始贴壁，2-3d进入指数生长期，细胞增殖速度较快，4-6d进 入平台期。细胞生长速度平稳，呈单层贴壁生长。大部分细胞呈类梭形，形态不规则。
[0055] 2)成脂分化诱导：
[0056]取第3代TOLSCs，按1X104cells/mL密度接种于12孔培养板内，培养至细胞汇合度 达到70-80%以上时，换成脂诱导液培养3d，每隔3d换液，连续诱导7-21d。
[0057] 实施例2
[0058]本实施例与实施例1基本相同，仅使用的成脂分化诱导培养基不同。本实施例中使 用的成脂分化诱导培养基含有下述含量的下述组分：0.1mm〇L/LIBMX、10mg/L胰岛素、 0.ImmoL/L吲哚美辛、lymoL/L地塞米松、5v/v%PRP、1Ov/v%FBS，余量为DMEM/F12培养基。 [0059]实施例3
[0060] 本实施例与实施例1基本相同，仅使用的成脂分化诱导培养基不同。本实施例中使 用的成脂分化诱导培养基含有下述含量的下述组分：0.1mmoL/LIBMX、10mg/L胰岛素、 0.ImmoL/L吲哚美辛、lymoL/L地塞米松、10v/v%PRP、10v/v%FBS，余量为DMEM/F12培养基。
[0061] 为了验证本发明成骨分化诱导的效果，以实施例1-3中诱导液及方法进行成脂分 化诱导作为实验组1-3,同时设置阴性对照组和阳性对照组，对实验组和对照组进行油红0 染色、过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2(PPARγ-2)和脂蛋白脂酶(LPL)的表达检测。每个 对照组都与实施例1基本相同，仅使用的成脂分化诱导液(或培养液)不同。
[0062]阴性对照组的培养液为含体积分数10 %FBS的DMEM/F12培养基。
[0063]阳性对照组中的成脂分化诱导液由下述含量的下述组分组成:0. lmm〇L/L IBMX、10mg/L胰岛素、0.1mmoL/L吲哚美辛、lymoL/L地塞米松、10v/v%FBS，余量为DMEM/F12培养 基。
[0064]效果实施例1、油红0染色
[0065]按照实验组或对照组方法对牙周膜干细胞进行培养或成脂分化诱导，分别在第 7d、14d和21d对细胞进行油红0染色。
[0066]对油红0染色的细胞进行计数，计算出各组的分化率，结果如表3和图3-图8所示。 诱导分化率的计算方法为:在倒置显微镜100倍放大视野下，每孔随机记数3个视野，计算分 化细胞占细胞总数的比例，每次平行计数3个孔，计算平均数）。
[0067]诱导分化率=染色阳性细胞数/细胞总数X 100%..................(1)
[0068] 表3、各组诱导分化率
[0069]
[0070] 结果显示培养21d后，阴性对照组不含诱导因子，不对细胞进行成脂分化诱导，因 此，没有着色，成脂分化率为零。实验组2与其他各组均有显著性差异(P<0.01，**);实验组1 与阳性对照组、实验组3有显著性差异(P<0.01，*);实验组3与阳性对照组无显著性差异。实 验组2中的成脂分化率均值为96.25±1.04%，是阳性对照组的近2倍。说明本发明实施例2 所示的成脂分化诱导液进行成脂分化诱导的效果最好。
[0071] 效果实施例2、PPARγ-2和LPL的表达检测
[0072]按照实验组或对照组方法对牙周膜干细胞进行培养或成脂分化诱导，连续诱导培 养7d、14d和21d后对细胞进行PPARγ-2和LPL的表达检测。
[0073]按TRIzol试剂盒说明书进行细胞总RNA提取;M-MLV反转录试剂盒获得cDNA。按SYBR Green定量PCR试剂盒说明书对PPARγ-2、LPL表达水平进行检测。以GAPDH作为内参基 因。以2-Δ^法进行定量分析。使用的引物如表4所示。结果如图9和图10所示。
[0074]表4、引物序列表[0075]
[0077] 实验结果表明，细胞诱导培养7d、14d、21d后，在同一时间点，各诱导组与未诱导组 (阴性对照组）比较，成脂细胞标志性基因PPARy-2、LPL表达水平均有显著性差异（P< 0.01)，实验组1与阳性对照组、实验组3有显著性差异(P<0.01，*);实验组2与其他各诱导组 均有显著性差异(Ρ<〇·〇1，**)。
[0078]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种牙周膜干细胞成脂分化诱导液，其特征在于，包含基础培养基、IBMX、胰岛素、B引 哚美辛、地塞米松、PRP和FBS。2. 根据权利要求1所述的牙周膜干细胞成脂分化诱导液，其特征在于，所述牙周膜干细 胞成脂分化诱导液中PRP的含量为l-lOv/ν%。3. 根据权利要求2所述的牙周膜干细胞成脂分化诱导液，其特征在于，所述牙周膜干细 胞成脂分化诱导液中PRP的含量为5v/v%。4. 根据权利要求1所述的牙周膜干细胞成脂分化诱导液，其特征在于，由下述含量的下 述组分组成：0 ·ImmoL/LIBMX、10mg/L胰岛素、0 ·ImmoL/L吲噪美辛、lymoL/L地塞米松、5v/ v%PRP、1Ov/v%FBS，余量为基础培养基，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。5. 根据权利要求1所述的牙周膜干细胞成脂分化诱导液，其特征在于，所述PRP通过以 下方法制备：10mL自体外周血于400g条件下离心lOmin，离心结束后血样自上而下依次分为 上清层、白色细胞层和红色细胞层，取红色细胞层上部l_2mm以及全部的上清层和白色细胞 层，在400g条件下离心5min，离心结束后血样自上而下依次分为上清层、白色细胞层和红色 细胞层，取上清层和白色细胞层在1200g条件下离心5min，离心结束后保留最下面2.5mL即 为PRP。6. 根据权利要求5所述的牙周膜干细胞成脂分化诱导液，其特征在于，PRP在使用前需 要进行活化，所述活化方法为:将PRP移入含氯化钙的促凝管，4°C过夜后在800g条件下离心 12min，取全部上清0.22μπι过滤，即得活化后的PRP。7. -种牙周膜干细胞成脂分化诱导方法，其特征在于，使用权利要求1-6任一项所述成 脂分化诱导液进行诱导。8. 根据权利要求7所述的牙周膜干细胞成脂分化诱导方法，其特征在于，所述牙周膜干 细胞成脂分化诱导方法，包括以下步骤:牙周膜组织消化后进行细胞培养，分选出STRO-Γ TOLSCs进行培养，使用上述成脂分化诱导液对第2-5代TOLSCs进行诱导。9. 根据权利要求8所述的牙周膜干细胞成脂分化诱导方法，其特征在于，使用磁珠分选 法分选出STRO-1+PDLSCs，磁珠分选法为:将收集消化后培养的细胞与STR0-1单抗4°C孵育 lh，与磁珠在4°C孵育30min，在磁力设备作用下筛选出STRO-1+PDLSCs。10. 根据权利要求9所述的牙周膜干细胞成脂分化诱导方法，其特征在于，所述牙周膜 干细胞成脂分化诱导方法，包括以下步骤： l)PDLSCs原代分离及传代： 刮取牙齿根中下1/3段的牙周膜组织，剪成约为1mm3大小;加入适量胶原酶-Dispase酶 1:1混合消化液，37°C消化30-35min后，lOOOrpm离心5min，弃上清，加入适量PBS重悬， lOOOrpm离心5min，弃上清，加入含体积分数10 %FBS的DMEM/F12培养基重悬细胞，调整细胞 密度至1Xl〇4cel1s/mL，2mL每孔接种于六孔板，于5 %C〇2、37°C条件下培养； 待细胞长至汇合度80-90 %，收集细胞，用磁珠分选法分选出STRO-1+PDLSCs，用含体积 分数10%FBS的DMEM/F12培养基重悬细胞，调整细胞密度至1X104cells/mL，2mL每孔接种 于六孔板中，于5 %C02、37°C条件下培养； 待细胞长至汇合度80-90 %，弃培养液，加入适量0.25m/v%胰蛋白酶溶液，消化1-3min，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含体积分数10 %FBS的DMEM/F12培养基终止 消化，收集细胞，lOOOrpm离心5min，弃上清；用含体积分数10%FBS的DMEM/F12培养基重悬 细胞，调整细胞密度至5X104cells/mL，接种于培养皿中于5 %C02、37°C条件下进行传代培 养，每隔2-3天换液一次； 2)PDLSCs成脂分化： 取第3代PDLSCs，按1X104cells/mL密度接种于12孔培养板内，培养至汇合度达到70-80%以上时，更换为上述成脂分化诱导液，每隔3天换液，连续诱导7-21天。
【专利摘要】本发明涉及一种诱导牙周膜干细胞成脂分化诱导液及方法。所述成脂分化诱导液包含基础培养基、IBMX、胰岛素、吲哚美辛、地塞米松、PRP和FBS；优选由下述含量的下述组分组成：0.1mmoL/L？IBMX、10mg/L胰岛素、0.1mmoL/L吲哚美辛、1μmoL/L地塞米松、5v/v％PRP、10v/v％FBS，余量为基础培养基，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。所述成脂分化诱导方法，包括使用上述成脂分化诱导液进行诱导。本发明在常规的诱导培养液基础上添加了PRP，有效提高了PDLSCs的脂肪化效率，能够成功实现对PDLSCs的成脂诱导。
【IPC分类】C12N5/077, C12N5/074
【公开号】CN105462917
【申请号】CN201510869488
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 戚康艺
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年11月30日