0046] (2)种子的培养:低温保藏的深海真菌Trichoderma sp.SCSI0W21经复苏后，将此 菌株接入到上述种子培养基中，于27~29°C、220r/min转速下摇床培养47~49小时得到种 子培养液。
[0047] 2.发酵培养：
[0048] (1)配制发酵培养基(大米固体培养基）：称取450克海盐溶于14~16升的去离子水 中，待海盐完全溶解后，平均分装于60个装有140~160克大米的2000mL的锥形瓶中，浸泡过 夜。121°C高压灭菌40分钟，获得灭菌的发酵培养基。
[0049] (2)发酵培养:在超净的工作台中，将5mL种子培养液接入装有140~160克大米的 2000mL的锥形瓶中，总共60瓶。室温静置培养40~50天，获得深海真菌Trichoderma sp. SCSI0W21的发酵培养物。
[0050] 3.提取分离：
[00511将上述每瓶固体发酵液用350~450mL的乙酸乙酯超声萃取，萃取液在低于50°C下 减压浓缩得发酵液浸膏，反复萃取3次，合并得到发酵液浸膏20克。该发酵液浸膏拌入200-300目的硅胶后装硅胶柱，经硅胶柱层析分离，采用氯仿-甲醇（体积比100 :0,99:1，98:2， 97:3,96:4,95:5,9 :1，8:2,7:3,6:4,0:100)梯度洗脱，经11(：分析，根据极性大小的不同，减 压浓缩后，相应的得到11个馏分。选取组分W21-1和W21-2分别进行反向硅胶柱层析分离，以 水-甲醇为洗脱溶剂梯度洗脱(体积比8:2,4 :6,3:7)，经1(：分析，分别得到组分121-1-1、 W21-2-1。组分W21-1-l、W21-2-l用反向HPLC柱进一步分离纯化，0-30min内甲醇浓度分别由 30 %和50 %等浓度冲洗，收集后即可得到纯化的所述倍半萜类化合物。
[0052] 二、提取物的相对结构鉴定
[0053] 对上述步骤中所得到的倍半萜类化合物进行结构分析测试，得到以下理化性质数 据：
[0054] 式（I)化合物，无色油状物；[a]25D-14.4(c 0.11，CHCl3);IR(neat)vmax 3450， 3371,2965,1381,1162,1024,920,724cm-SHR-ESmS m/z 297.2131 [M+Na] + (calcd. for Ci5H3〇〇4Na，297 · 2154);咕 NMR(600MHz，DMS〇-d6)和13C NMR(100MHz，DMS〇-d6)数据见如下表 l〇
[0055] 表1:式（I)化合物的NMR数据（600/125MHz，DMS0-d6，TMS为内标 JinHzjin ppm)
[0058]根据以上理化数据分析可知，此化合物为倍半萜类化合物，其相对结构如式（I)所 示：
[0060] 式（I)
[0061] 式（Π )化合物，Cyclonerodiol:无色油状物；[a]25D-5. l(c 0.09，CHC13) ;IR (neat)vmax 3428,2963,1673,1453,1376,1147，918,884,817cm-1 ;HR-ES頂S m/z259.1718[M +H20+H] + (calcd.for (^15113103,259.1698)5? Mffi(400MHz，DMS0-d6和CDC13)和 13C 匪R (100MHz，DMS〇-d6 和 CDC13)数据见如下表 2。
[0062] 表2 式（Π )化合物的NMR数据(400/100MHz，DMS0_d6和CDC13，TMS为内标 Jin Ηζ,δ in ppm)
[0063]
[0064]根据以上理化数据分析可知，此化合物为倍半萜类化合物，其相对结构如式（Π ) 所示：
[0067] 式（ΙΠ )化合物，Epicyclonerodiol oxide :无色油状物；[a]25d_12 · 5(c 0 · 08， acetone)；IR(neat)vmax 3425,2966,2874,1456,1371,1124,1054,885cm_1 ； HR-ESIMS m/z 279.1930[M+Na] + (calcd.for (^15112803^,279.1936)5? Mffi(400MHz，CDCl3)和 13C 匪R (100MHz，CDC13)数据见如下表3。
[0068] 表3 式（m)化合物的NMR数据(400/100MHz，DMS0-d6和CDC13，TMS为内标，Jin Ηζ,δ in ppm)
[0069]
[0070]根据以上理化数据分析可知，此化合物为倍半萜类化合物，其相对结构如式（m) 所示：
[0073]实施例2:对实施例1所得到的3个倍半萜类化合物的抗Αβ聚集活性的筛选实验。 [0074]抗Αβ多肽聚集活性可以采用ThT方法测定，即采用硫磺素 T(ThT)嵌入Αβ42多肽的β-折叠片层中，后者受到激发产生荧光，可用于定量检测Αβ42多肽的聚集状态。利用此模型可 直接筛选抗Αβ 42蛋白聚集的活性物质，并比较其活性大小。将0.5mg冻干的Αβ42多肽溶解于 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)，4°C震荡过夜。氮气吹干后，将多肽重新溶解于DMS0中使 其浓度达到200mol/L，超声15min，制成原液。在96孔板上加入含有20mol/L硫磺素 T的180L 磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4)，加入2OLA042原液，最后加入样品。将表没食子儿茶素没食子 酸酯(EGCG)做为阳性对照，用荧光酶标仪测试反应体系的荧光强度，激发波长为444nm，发 射波长为485nm。根据以下公式计算每一个样品的相对抑制活性(Vi):Vi(%) = 100-[(Fi-Fb)/FO]X100，其中Fi为加入样品后的荧光强度，Fb为样品本身在此测定条件下的荧光强 度(无 Αβ42多肽），Fo为未加入样品时Αβ42自发聚集的荧光强度。3个倍半萜类化合物所测结 果见表4,表明在此浓度下，式（Π )化合物具有很强抗Αβ多肽聚集活性，式(I)和式(ΙΠ )化合 物有较强的抗Αβ多肽聚集活性。
[0075]表4式（I)至式（ΙΠ )化合物的抗Αβ42聚集活性结果(ThT模型）
[0077] 备注:ThT模型中相对抑制活性接近60 %的化合物具高活性。
[0078] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种真菌培养物的提取物，其特征在于，所述提取物为倍半祗类化合物;所述倍半祗 类化合物包括W下化合物，化合物的结构式如下所示：2. 如权利要求2所述的真菌培养物的提取物，其特征在于，所述倍半祗类化合物还包括 W下化合物中的一种或两种，化合物的结构式如下所示：3. 如权利要求1~2任意一项所述的一种真菌培养物的提取物的制备方法，其特征在 于，包括W下步骤： (1) 将真菌化ichoderma SP.接种到种子培养基中，获得种子培养液； (2) 按接种量将种子培养液接种到大米固体培养基中，室溫静置培养40~50天，获得发 酵培养液； (3) 将上述发酵培养液用乙酸乙醋萃取，获得萃取液，经浓缩、分离获得真菌 Trichoderma SP.培养物的无色油状提取物。4. 如权利要求3所述的真菌培养物的提取物的制备方法，其特征在于，所述萃取液浓 缩、分离的过程为:将萃取液在低于50°C下减压浓缩得发酵液浸膏;将发酵液浸膏经硅胶柱 层析分离、反向硅胶柱层析分离、反向HPLC分离纯化，获得真菌化ichoderma SP.培养物的 提取物。5. 如权利要求3所述的真菌培养物的提取物的制备方法，其特征在于，所述种子培养基 的成分，按照重量百分比计，包括:葡萄糖1.9~2.1%，蛋白腺0.9~1.1%，酵母提取物0.4 ~0.6%，海盐2~4%，其余为去离子水。6. 如权利要求3所述的真菌培养物的提取物的制备方法，其特征在于，所述大米固体培 养基的成分包括海盐、去离子水和大米;所述海盐、去离子水、大米的质量比为7~8:240~ 260:140~160。7. 如权利要求3所述的真菌培养物的提取物的制备方法，其特征在于，所述接种量为每 ImL种子培养液对应28~3?大米培养基。8. 如权利要求3所述的真菌培养物的提取物的制备方法，其特征在于，所述萃取过程具 体为：按比例向发酵提取液中添加乙酸乙醋，所述乙酸乙醋与发酵提取液的体积比为70~ 90:5〇9. 如权利要求1~2任意一项所述的一种真菌培养物的提取物的应用，其特征在于，所 述提取物用于制备抗A042聚集活性的制剂。10. 如权利要求9所述的真菌培养物的提取物的应用，其特征在于，所述提取物用于制 备治疗阿尔茨海默病的药物。
【专利摘要】本发明适用于生物医药技术领域，提供了一种真菌培养物的提取物及其制备方法和应用，所述提取物是从真菌Trichoderma？sp.的培养发酵液的乙酸乙酯萃取液中浓缩、分离得到的无色油状物；所述无色油状物为倍半萜类化合物。本发明提供了上述提取物的制备方法，包括以下步骤：真菌Trichoderma？sp.的种子培养、发酵培养、发酵培养物的提取。本发明制备的提取物可以用于制备治疗阿尔茨海默病的药物。本发明为阿尔茨海默病药物的制备提供了新的方法。
【IPC分类】C07C35/06, C12P17/04, A61P25/28, C07C29/76, C12P7/02, A61K31/047, A61K31/341, C07D307/12
【公开号】CN105503531
【申请号】CN201510884270
【发明人】王立岩, 周香, 李晓帆
【申请人】深圳大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月4日