r>[0089] PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1 次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1.5mL离屯、管中，混匀后瞬 时离屯、，分装到每个〇.2mL Eppendo计PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离屯、后进行PCR 扩增；
[0090] PCR反应体系见表2:
[0091] 表2PCR反应体系
[0094] 15化反应体系包括0.5U Taq DM聚合酶（北京天根科技有限公司），2XBuffer 7.扣L(内含Mgh、dNTPs等）（北京天根科技有限公司Mix)，50ng/此含L邱tin基因的黄牛基因 组DNA 1. OyL，1 Opmo 1 /μL上、下游引物各0.25化；
[009引 PCR反应程序：
[0096] 95°C 预变性 5min;
[0097]
[009引 72°C 延伸 lOmin; 4°C 保存。
[0099] 对5个黄牛品种的465个样本的基因组DNA进行PCR扩增，获得465个个体的黄牛 Leptin基因中包含该SNP位点的148bp的DNA片段。
[0100] cUPst I酶切消化PCR扩增的L邱tin基因片段
[0101] l、Pst I酶切反应消化体系（20yL):5化 PCR产物，10XH Buffer缓冲液2.0yL，Pst 1( 1抓AiUO.^iL，灭菌超纯水化20)12.5化。
[0102] 2、酶切消化条件:37°C恒溫培养箱中消化5~lOh。
[0103] e、Pst I消化PCR产物后聚丙締酷胺凝胶电泳分析
[0104] 1)制作12%的聚丙締酷胺凝胶，点样后200V电压电泳化，电泳结束后硝酸银染色；
[0105] 2)根据聚丙締酷胺凝胶电泳结果分析SNP多态性：
[0106] 根据银染结果判断SNP的多态性：
[0107] PCR扩增L邱tin基因的第12264bp~12269bp序列为q；GCA.G时，其能被限制性内切 酶Pst I识别；当上述该位点发生T乂突变时，PCR扩增L邱tin基因的第12264bp~12269bp 序列为CgiCAG，此时不能被限制性内切酶Pst I所识别，运样就可W对该位点SNP多态性进 行检测。序列中最后一位加粗的G为下游引物中引入的错配碱基(表现在反向引物上为其互 补序列C)，它可与12265位的SNP共同构成Pst I的识别位点。
[010引因此，黄牛基因组的Leptin基因第12265位的SNP多态性的聚丙締酷胺凝胶电泳电 泳结果为：
[0109] TT基因型表现为28化P和15bp两条带;CT基因型表现为29化p，28化p，15bpS条带； CC基因型表现为29化p-条带。（其中15bp的片段因条带过小不能在聚丙締酷胺凝胶电泳上 显示，但不影响带型的判定）。
[0110] 图2为Pst I化FP-PCR方法检测黄牛Leptin基因第二外显子SNP(AC_000161.1: g.l2265T〉C)序列分析图，其中带框部位分别表示上下游引物序列，红色背景的碱基表示 SNP位点，黄色背景的碱基表示下游引物中引入的错配，目的是与SNP共同构成Pst I的酶切 位点。黑色下划线为Pst I的识别位点。
[0111] 图3(a)所示为酶切后的聚丙締酷胺凝胶电泳检测结果：TT基因型个体（281bp， 15bp); CT基因型个体（296bp，28化P，1 化P); CC基因型个体（296bp); Μ: DL500 (500bp，400bp， 30化p, 20化p, 15化p, lOObp, 50bp)。注：1化p条带太短不能在聚丙締酷胺凝胶电泳上显示， 但不影响带型的判定。
[0112] 3)不同基因型个体PCR产物的测序验证
[0113] 对不同基因型个体PCR产物分别进行正向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明 包含296bp，28化P和15bp条带的杂合子CT基因型个体其12265位的测序结果的确表示为C或 T，如图3(b)所示，自左向右第7个峰为两个峰。而TT、CC基因型分别为T和C，测序峰图为单一 峰，如图3(b)所示。
[0114] f、黄牛Leptin基因 SNP位点的频率统计分析
[0115] 1)基因和基因型频率
[0116] 基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。Ρττ =Νττ/Ν，其中Ρττ代表某一位点的ΤΤ基因型频率;Νττ表示群体中具有ΤΤ基因型的个体数;Ν为 检测群体的总数量。
[0117] 基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式 可W写成:ΡΤ = ( 2NTT+NTal+NTa2+NTa3+NTa4+……+NTan ) /2N式中，Ρτ表示等位基因 T频率，ΝτΤ表示 群体中具有ΤΤ基因型的个体数量，化31表示群体中具有化i基因型个体数量，al-an为等位基 因 T的η个互不相同的复等位基因。
[0118] 本研究所设及的等位基因为Τ和C，所W具体的基因频率计算公式为：
[0119] Pt=(2Ntt+Ntc)/2N
[0120] Pc=(2Ncc+^c)/2N
[0121] 式中，Ρτ，Pc分别表示等位基因巧PC等位基因的频率，Νττ、化c和Ncc分别表示ΤΤ、TC和 CC基因型的个体数量，N表示总群体数目。
[0122] 如表3所示的基因频率分布表，在不同黄牛品种Leptin基因 SNP中的T等位基因频 率变化幅度在21.4%~31.6%，C等位基因频率变化幅度在68.4%~78.6%之间。符合等位 基因频率大于1.0%的SNP的定义，故本位点为单核巧酸多态位点。
[0123] 表3黄牛L邱tin基因第1226化P SNP位点的Pst I forced-PCR-RFLP的频率分布表
[0124]
[012引g、黄牛Leptin基因 SNP位点基因效应的关联分析
[0126] 基因型数据:Pst I识别的基因型(TT和CT)
[0127] 生产数据：南阳牛不同月龄生长性状，包括初生重，6月龄、12月龄、18月龄和24月 龄的体重、体高、体斜长、胸围、坐骨端宽和平均日增重。
[012引关联分析模型：
[0129] 先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正； 根据数据特征，应用SPSS(18.0)软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进 行分析时采用了固定模型：
[0130] Yijki = y+邸 i+Monthj+Gk+euki
[0131] 其中：Yijki为性状观察值，μ为总体均值，BFi为第i个品种和农场的固定效，Monthj 为第j个月观测的固定效应，扣为第k个单SNP标记基因型的固定效应，ei耻为随机误差。
[0132] 结果表明（见表4):在南阳牛群体中，CT基因型个体的初生重显著高于TT基因型个 体(P<0.05)，CT基因型个体的体重（12月龄）显著高于CC基因型个体(Ρ<0.05)，ΤΤ基因型个 体的胸围（24月龄)显著高于CC基因型个体(Ρ<0.05)。说明CT和ΤΤ基因型可W作为一个提高 黄牛早期体重和胸围的候选分子遗传标记。
[0133] 表化eptin基因第12265位多态位点与南阳牛初生重及各月龄生产指标间的方差 分析
[0134]
[0135]
[0136] 注:数字肩部具有不同字母者(如a和b，A，B和C等)表示差异异显著(P<0.05)，或差 异极显著(p<0.01)。
【主权项】
1. 一种检测黄牛Lept in基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含Lept in基因 的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，采用PCR法扩增黄牛Leptin基因的第二 外显子片段;然后用限制性内切酶Pst I消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行聚丙烯 酰胺凝胶电泳;根据电泳结果鉴定黄牛Leptin基因第12265位点的单核苷酸多态性为:TT基 因型表现为28 lbp和15bp两条带;CT基因型表现为296bp，281bp，15bp三条带;CC基因型表现 为296bp-条带； 所述的引物对PS: P1 (上游引物）：5 '-GTGCCTTTCATTACTGTCATTTC-3 ' 23bp P2 (下游引物）：5 ' -TGTCATCCTGGACCgrGC-3 ' 18bp。2. 如权利要求1所述，检测黄牛Leptin基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述 的PCR扩增反应程序为： 95°C预变性5min; 94°C变性30s，59°C退火30s，72°C延伸30s，30~35个循环；72°C延伸 10min;4°C 保存。3. 如权利要求1所述，检测黄牛Lept in基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述 的聚丙烯酰胺凝胶电泳为质量浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
【专利摘要】本发明公开了一种检测黄牛Leptin基因单核苷酸多态性的方法，以包含Leptin基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，采用PCR法扩增黄牛Leptin基因的第二外显子片段，然后用限制性内切酶Pst？I消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳结果鉴定黄牛Leptin基因第12265位点的单核苷酸多态性。由于Leptin基因在调控动物生长、脂肪分化及肉质形成方面具有重要的生物学功能，本发明提供的检测方法为Leptin基因的SNPs与生长性状关联的建立奠定了基础。本发明还发现，Leptin基因12265(T/C)位点对南阳牛早期生长性状初生重、体重、胸围指数有显著影响。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105506114
【申请号】CN201610003228
【发明人】马云, 付玮玮, 陈宁博, 郝瑞杰, 李芬, 李俊雅, 张路培, 张琼琼, 刘云云
【申请人】信阳师范学院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月4日