一种提高多粘芽孢杆菌产抗真菌物质的方法
【专利说明】一种提高多粘芽孢杆菌产抗真菌物质的方法
[0001 ]本发明得到天津市自然科学基金13JCYBJC25500资助。
技术领域
[0002]本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种利用维生素C提高多粘类芽孢杆菌产抗真菌物质的方法。
【背景技术】
[0003]在真菌引起的植物病害现已成为经济农作物和药用植物稳产、高产、优产的主要障碍，这些会导致经济上的损失，还会产生对人类身体有害的霉菌毒素，使得真菌病害的防治显得更为重要。目前使用的杀真菌剂大部分会造成环境风险，所以可以取代这些化学物质环境友好型的生物防治物质成为研究热点。
真菌病害是植物病害中最重要的一类，可占到植物病害的80%以上，约3万种，导致发展中国家的农作物损失超过了 12%。真菌既危害生长期的作物，又危害采摘后的作物产品，如镰刀菌属能感染植物的根和其它部位，灰葡萄孢菌能引起200多种植物的绿色组织病变并且可以使储存中的水果变质。真菌引起的植物病害现已成为经济农作物和药用植物稳产、高产、优产的主要障碍，使得真菌病害的防治显得更为重要。我们采取了使用杀真菌剂来对抗这些病原体，但这些杀菌剂大部分会造成环境风险，所以可以取代这些化学物质环境友好型的生物防治物质成为研究热点。芽孢杆菌类的菌株可以产生多种抗菌药物，包括羊毛硫抗生素、脂肽和大环内酯物等。目前促进多粘芽孢杆菌产抗菌物质的手段大多采用基因分子手段，但是，由于基因操作本身过程相对繁琐、实验周期相对较长的限制，加之构建载体再生过程中外源基因的导入或内源基因的修饰均可能导致整个代谢途径的扰动，从而影响目标代谢途径物质流和能量流分配，最终影响抗真菌物质的形成。因此，寻找一种更为简单且有效的方法尤为重要。由于外源还原剂(如GSH和微生物C)的添加可以够影响到细胞所处环境氧化还原态势，目前，通过外源还原剂的添加来调节生物所处外部环境的氧化还原电势，促进I，3_丙二醇、(R，R)-2，3-丁二醇等目标产物的积累已有报告。但利用外源还原剂VC来提高产抗真菌物质的报道尚未见到。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种利用维生素C促进多粘类芽孢杆菌产抗真菌物质的方法，包括如下步骤:
(1)种子培养:将多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)CJX-518保藏编号为CGMCC N0.7096在种子培养基中培养，得到一级种子;将一级种子在种子培养基中培养，得到二级种子;上述的种子培养基成分以g/L计:淀粉30，葡萄糖5，酵母浸粉2，蛋白胨4，MgS(V7H20 0.5，NaCl 0.5,K2HPO4 1.5，121°C蒸汽灭菌20 min；
(2)发酵培养:按体积百分比为1%的接种密度将一级种子接入发酵培养基中，搅拌转速为200rpm，温度为37 °C条件下发酵72h，当发酵4h时，不同实验组分别添加10、30和200 mg/L的维生素C水溶液
所述发酵培养基由下述成分以g/l计组成:葡萄糖20，酵母浸膏粉3，NaCl 1，KH2PO42，(NH4)2S04 I,MgSO4.7H20 0.3,KCl 0.2,CaCl2 0.02, FeSO4.7H20 0.002,MnSO4.H2O
0.002,pH 为7.0。
本发明涉及的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，命名为Paenibacilluspolymyxa CJX-518。并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneral Microb1logical Cultuer Collect1n Centre)，保藏号:CGMCC 7096。保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101，多粘类芽孢杆菌保藏的时间2013-01 -08。
本发明进一步公开了利用维生素C促进多粘类芽孢杆菌产抗真菌物质的方法在制备产抗真菌活性物质方面的应用。实验结果表明:在发酵过程中，选择在菌体有一定积累的时期添加1、30、200 mg/L的维生素C水溶液降低了因还原剂对微生物的毒害作用而导致目标产物积累受阻的影响;最终促进发酵液中抗真菌活性物质的积累。
本发明公开的提高多粘芽孢杆菌产抗真菌物质的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于:
本发明特征在于在P.polymyxa CJX-518发酵过程中，在发酵培养基中添加还原剂维生素C，浓度为10、30和200mg/L;添加时间选择在菌体有一定积累的时期(4h)，相对以往报道的在发酵起始阶段添加还原剂的方式，如添加维生素C对产琥珀酸放线杆菌合成丁二酸的影响中，发现在发酵起始阶段添加维生素C，对菌体生长的作用并不明显，40mg/L的维生素C虽然能促进单位质量菌体合成琥珀酸，但是与对照相比效果并不显著，增加20%;这是因为在发酵起始阶段添加外源还原剂可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死，所以本发明选择在菌体有一定积累时添加，可以降低因还原剂对微生物的毒害作用而导致目标产物积累受阻的影响;最终促进发酵液中抗真菌物质的积累。
【附图说明】
[0005]
图1为添加10 mg/L的维生素C对P.polymyxa CJX-518发酵过程中生物量积累的影响； 图2为添加30 mg/L维生素C对P.polymyxa CJX-518发酵过程中生物量积累的影响；
图3为添加200 mg/L维生素C对P.polymyxa CJX-518发酵过程中生物量积累的影响； 图4为添加10 mg/L维生素C对P.polymyxa CJX-518产抗真菌物质的影响；
图5为添加30 mg/L维生素C对P.polymyxa CJX-518发酵过程中产抗真菌物质的影响； 图6为添加200 mg/L维生素C对P.polymyxa CJX-518发酵过程中产抗真菌物质的影响；
图7为P.polymyxa CJX-518发酵上清液抑制立枯丝核菌(A)和灰葡萄孢子(B)生长示意图。
[0006]【具体实施方式】:
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下将一种产2，3-丁二醇的多粘类芽孢杆菌(Paenibaci Iluspolymyxa) CJX-518保藏编号为CGMCC 7096简称CJX-518。
实施例1:添加维生素C的发酵
一种利用维生素C提高多粘类芽孢杆菌产抗真菌物质的方法，包括如下步骤:
(1)培养基的配制
土豆培养基(PDA培养基):取去皮的土豆200g，切成小块，加100ml水煮沸至一触及破，用6层纱布收集滤液，加20g葡萄糖，20g琼脂，定容至100ml，分装后121°C蒸汽灭菌20min;
种子培养基成分以g/L计:淀粉30，葡萄糖5，酵母浸粉2，蛋白胨4，MgS(V7H20 0.5，NaCl 0.5,K2HPO4 1.5，121°C蒸汽灭菌20 min；
发酵培养基成分以g/L计:葡萄糖20，酵母浸膏粉3，NaCl 1，KH2PO4 2, (MM)2SO4 1，MgSO4.7H20 0.3,KCl 0.2,CaCl2 0.02, FeSO4.7H20 0.002,MnSO4.H2O 0.002,pH 为7.0，121°C蒸汽灭菌20 min；
(2)摇瓶培养
一级种子的培养
将CJX-518甘油菌接入50mL的种子培养基中，在温度37°C，转速200rpm条件下，培养24h，制得一级种子培养液；
(3)发酵培养
按体积百分比为1%的接种密度将一级种子接入250ml装有10mL发酵培养基的三角瓶，搅拌转速为200印111，温度为37°(:，发酵7211。
在发酵4h时，各实验组分别加入终浓度为10、30、200 mg/L的维生素C水溶液，各时间段检测到的生物量积累如图1所示，生成的抗真菌物质如图2所示。添加30mg/L的维生素C促进效果最好，在36h、48h和60h时与对照相比，生物量积累分别提高了 17.9%、10.6%和9.97%;抗真菌活性分别提高了 72%、61.4%和61%。
(4 )抗真菌活性的测定
多粘芽孢杆菌抗真菌活性的测定采用牛津杯法，指示菌为立枯丝核菌和灰葡萄孢子，分别在经预培养的立枯丝核菌和含有灰葡萄孢子的PDA平板上放4个灭菌的牛津杯，取灭过菌的发酵上清液液SOyL点样于牛津杯内，待菌液干后，28°C倒置培养培养48h。
实施例2
对照组:不添加维生素C的发酵
(I)、(2)和(4)同实施例1步骤(1)、(2)和(4);
(3)按体积百分比为1%的接种密度将一级种子接入250ml装有10mL发酵培养基的三角瓶，搅拌转速为200 rpm，温度为37 V，发酵72h。36h、48h、60h时间段检测到的生物量积累如图1所示，生成的抗真菌物质如图2所示。
结论:
(1)发酵过程中添加10mg/L、30mg/L、200mg/L的维生素C促进P.polymyxa CJX-518的生物量积累；
(2)发酵过程中添加10mg/L、30mg/L、200mg/L的维生素C促进P.polymyxa CJX-518的产抗真菌活性物质； (3)添加30mg/L的维生素C促进效果最好，在36h、48h和60h时与对照相比，生物量积累分别提高了 17.9%、10.6%和9.97%;抗真菌活性分别提高了 72%、61.4%和61%。
【主权项】
1.一种利用维生素C提高多粘类芽孢杆菌产抗真菌物质的方法，其特征是包括如下步骤: (1)种子培养:将多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) CJX-518保藏编号为CGMCC N0.7096在种子培养基中培养，得到一级种子;所述的种子培养基成分以g/L计:淀粉30，葡萄糖 5，酵母浸粉 2，蛋白胨 4,MgSO4-7H20 0.5,NaCl 0.5,K2HPO4 1.5，121°C蒸汽灭菌20min; (2)发酵培养:按体积百分比为1%的接种密度将一级种子接入发酵培养基中，搅拌转速为200rpm，温度为37°C条件下发酵72h;当发酵4h时，不同实验组分别添加10、30和200 mg/L的维生素C水溶液。2.权利要求1所述的方法，其特征是所述发酵培养基由下述成分以g/L计组成:葡萄糖20，酵母浸膏粉3，NaCl 1，KH2PO4 2, (NM)2SO4 I ,MgSO4.7H20 0.3,KCl 0.2,CaCl20.02, FeSO4.7H20 0.002,MnSO4.H2O 0.002,pH 为7.0。3.权利要求1述利用维生素C促进多粘类芽孢杆菌产抗真菌物质的方法在促进发酵液中抗真菌活性物质的积累方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种利用外源添加还原剂维生素C提高多粘类芽孢杆菌(<i>Paenibacillus？polymyxa</i>)？CJX-518产真菌物质的方法，属于发酵工程技术领域。本发明通过在发酵过程中，将多粘类芽孢杆菌(<i>Paenibacillus？？polymyxa</i>)？CJX-518保藏编号为CGMCC？NO.7096在种子培养基中培养，得到一级种子。按体积百分比为1%的接种密度将一级种子接入发酵培养基中，搅拌转速为200rpm，温度为37℃条件下发酵72h;当发酵4h时，不同实验组分别添加10、30和200？mg/L的维生素C水溶液。该方法促进P.？polymyxa？CJX-518抗真菌物质的积累。分批发酵方式下利用本方法可促使<i>P.？polymyxa</i>？CJX-518产抗真菌物质显著提高。CGMCC No.709620130108
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/01, C12P1/04
【公开号】CN105602996
【申请号】CN201610088613
【发明人】徐秋曼, 赵倩倩, 程景胜
【申请人】天津师范大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年2月17日