线粒体靶向的基因编辑系统及方法

线粒体靶向的基因编辑系统及方法
【专利说明】线粒体靶向的基因编辑系统及方法
[技术领域]
[0001] 本发明涉及一种基因编辑系统及方法，具体涉及一种线粒体靶向的基因编辑系统 及方法。
[【背景技术】]
[0002] 目前基因组定点编辑/修饰的基本原理是利用在靶位点区自发或诱发的DNA双链 缺口（double-strain breaks，DSBs)，DSBs将激活细胞内的DNA修复机制来进行基因组的改 造，比如非同源区的末端连接(NHEJ)或是同源重组(HR)(附图1)。
[0003] 在细胞内，乐观估计DSB自发产生的概率低于1/104,如果通过基因工程采用 spCas9和SaCas9等核酸酶诱发DSBs，效率可提高至10%以上，且具有位点特异性，可在内源 基因突变的位点诱发DSBs以便接下来的基因修复过程发生。DSBs激活细胞内的DNA修复机 制后，会有两种不同的修复机制竞争性的参与DSBs的修复，一种是非同源区的末端连接 (Non-homologous end joint-NHEJ),一种是同源重组（Homologous recombination-HR) 〇 要实现基因组的定点准确编辑，需要借助于同源重组修复机制。因此直接提高DSBs修复过 程中同源重组发生的频率或抑制非同源区的末端连接(NHEJ)都有助于提高基因组定点编 辑/修饰的效率。
[0004] 人体基因组包括细胞核基因组和线粒体基因组两部分，细胞核基因组和线粒体基 因组的突变均可能导致人类遗传病。目前的基因编辑技术主要针对的是细胞核基因组，因 此开发针对线粒体基因组的基因编辑技术修复线粒体基因对人类疾病的治疗同样有重要 的意义。
[0005] 要实现线粒体基因的编辑，需要将核酸酶特异性的定位于线粒体中。对于CRISPR-Cas9系统而言，负责引导Cas9蛋白基因组定位的sgRNA同样需要进入线粒体中方能让 CRISPR-Cas9系统在线粒体中发挥作用。Cas9蛋白和sgRNA的线粒体定位可以实现线粒体基 因的敲除，但要实现线粒体基因的定点编辑，还需要靶向线粒体的修复模板。
[0006] 现有的基因定点编辑原理主要是同源重组修复机制，因此需要同源修复模板。已 有的报道指出，可以介导同源重组修复的模板可以是双链DNA、DNA寡核苷酸链或RNA模板。 双链DNA和DNA寡核苷酸链难以实现线粒体定位，但借助于线粒体革E1向的RNA信号可以实现 RNA模板的线粒体定位。
[
【发明内容】
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[0007] 本发明的目的在于借助于线粒体革E1向的RNA信号实现RNA模板的线粒体定位。
[0008] 为了实现上述目的，提供一种线粒体靶向的基因编辑系统，其中包括：
[0009] a.线粒体靶向的DNA核酸酶，
[0010] b.线粒体靶向的SgRNA，
[0011 ] c.线粒体靶向的RNA修复模板。
[0012]所述的 DNA 核酸酶为 SpCas9、SaCas9、CPFl、ZFN、TALENs。
[0013] 线粒体靶向的DNA核酸酶的构建方法为：设计编码C0X8基因线粒体定位序列的互 补寡核苷酸链，退火后连入SpCas9的表达载体，得到⑶X8MTS-SpCas9融合蛋白，启动子为 CBh〇
[0014] 线粒体靶向的sgRNA构建的sgRNA的方法为:设计包含线粒体定位的RNA信号与针 对人源ND4基因的sgRNA的互补寡核苷酸链，退火后连入sgRNA的表达载体，得到mitoRNA signal-ND4sgRNA融合序列，启动子为U6。
[0015]线粒体靶向的RNA修复模板的制作方法为:采用DNA合成的方式，将线粒体定位的 RNA信号与带有HA标签序列的人源ND4修复模板融合得到mitoRNA signal-ND4-HA序列，酶 切连接进入U6表达载体
[0016] -种线粒体靶向的基因编辑方法，采用上述任一基因编辑系统，将线粒体靶向的 DNA核酸酶、线粒体革E1向的sgRNA和线粒体革E1向的RNA模板定位至线粒体中。
[0017]采用Lipofectamine 3000转染试剂将线粒体定位的DNA核酸酶、线粒体定位的 sgRNA和RNA修复模板的表达载体共转染入293细胞系，37度二氧化碳培养箱培养48小时。提 取细胞基因组DNA，采用HA特异性的正向引物和人源ND4特异性的反向引物进行PCR。
[0018] 本发明利用序列特异性的核酸酶在靶位点处或附近制造一个DNA双链缺口 (DSBs)，通过RNA模板实现靶位点处的同源重组修复。
[【附图说明】]
[0019] 图1为DSBs介导的基因编辑原理示意图；
[0020] 图2为线粒体基因修复-体系示意图；
[0021]图3为人源ND4同源互补模板构建示意图；
[0022]图4为ND4-HA基因编辑检测引物设计示意图，
[0023] 图5为ND4-HA的PCR验证图，
[0024] 图6为ND4-HA测序验证，序列比对图；
[0025]图7为人源MT-TK基因位点编辑，同源互补模板构建示意图；
[0026]图8为人源MT-TK基因位点编辑，检测引物示意图；
[0027] 图9为人源MT-TK基因位点编辑，PCR验证图；
[0028]图10为人源MT-TK基因位点编辑，测序验证序列比对图。
[【具体实施方式】]
[0029]以下结合实施例和附图对于本发明做进一步说明，实施例和附图仅用于解释说明 而不用于限定本发明的保护范围。
[0030]实施例1 一线粒体ND4基因定点敲入HA标签
[0031 ] 1.改造核酸酶SpCas9，构建线粒体定位的mito_SpCas9
[0032] 设计编码C0X8基因线粒体定位序列（mitochondrial-targeting sequence MTS) 的互补寡核苷酸链，退火后连入SpCas9的表达载体，得到C0X8MTS-SpCas9融合蛋白，启动子 为 CMi〇
[0033] 2.改造 sgRNA，构建线粒体定位的sgRNA
[0034] 设计包含线粒体定位的RNA信号与针对人源ND4基因的sgRNA的互补寡核苷酸链， 退火后连入sgRNA的表达载体，得到mitoRNA signal-ND4 sgRNA融合序列，启动子为U6。 [0035] 3.设计并合成与人源ND4互补的修复模板
[0036]采用DNA合成的方式，将线粒体定位的RNA信号与带有HA标签序列的人源ND4修复 模板融合得到mitoRNA signal-ND4-HA序列，酶切连接进入U6表达载体(图3)。
[0037] 4.转染293细胞系验证新系统的线粒体基因编辑效果
[0038] 采用Lipofectamine 3000转染试剂将步骤1、2和3构建的表达载体共转染入293细 胞系，37度二氧化碳培养箱培养48小时。提取细胞基因组DNA，采用HA特异性的正向引物和 人源ND4特异性的反向引物进行PCR，采用人源ND4特异性的正向引物和HA特异性的反向引 物进行PCR(图4-5)，回收目的片段后经测序确认线粒体的编辑可行性(图6)。
[0039] 实施例2-将人源MT-TK基因利用同源重组替换为小鼠线粒体MT-TK基因 [0040] 1.改造核酸酶SpCas9,构建线粒体定位的mit〇-SpCas9
[0041 ]设计编码C0X8基因线粒体定位序列（mitochondrial-targeting sequence MTS) 的互补寡核苷酸链，退火后连入SpCas9的表达载体，得到C0X8 MTS-SpCas9融合蛋白，启动 子为CBh。
[0042] 2.改造 sgRNA，构建线粒体定位的sgRNA
[0043] 设计包含线粒体定位的RNA信号与针对人源MT-TK基因的sgRNA的互补寡核苷酸 链，退火后连入sgRNA的表达载体，得到mitoRNA signal-MT-TK sgRNA融合序列，启动子为 U6〇
[0044] 3.设计并合成与人源MT-TK互补的基因组编辑模板
[0045]采用DNA合成的方式，将线粒体定位的RNA信号与带有HA标签序列的人源MT-TK基 因组编辑模板融合得到111；[1：01?祖8丨8仙1-]\11'-11(-代口13061116111：序列，其中将人源肌'-1'1(基因 替换为小鼠来源的MT-TK基因，酶切连接进入U6表达载体(图7)。
[0046] 4.转染293细胞系验证新系统的线粒体基因编辑效果
[0047] 采用Lipofectamine 3000转染试剂将步骤1、2和3构建的表达载体共转染入293细 胞系，37度二氧化碳培养箱培养48小时。提取细胞基因组DNA，采用小鼠 MT-TK基因特异性的 正向引物和人源MT-TK基因临近序列特异性的反向引物进行PCR，采用人源MT-TK基因临近 序列特异性的正向引物与小鼠 MT-TK基因特异性的反向引物进行PCR(图8-9)，回收目的片 段后经测序确认线粒体的编辑可行性(图10)。
[0048]发明中使用到线粒体定位的SpCas9表达载体构建详情如下:根据已有的报道，采 用DNA合成的方式获得SpCas9表达载体;根据已有的报道，合成Cox8线粒体定位序列，连入 SpCas9表达载体中。
[0049] SpCas9编码序列，如SEQ ID N0.1 所示。
[0050] C0X8线粒体定位序列，如SEQIDN0.2所示。
[00511 sgRNA构建:合成寡核苷酸链，经退火后连入U6启动子驱动的表达载体;U6启动子 采用DNA合成的方式获得。
[0052] ND4sgRNAdnSEQIDN0.3K*。
[0053] MT-TK sgRNA如SEQ ID NO .4所示。
[0054] 修复模板采用DNA合成的方式得到。
[0055] ND4-HA模板：如SEQIDN0·5所示。
【主权项】
1. 一种线粒体靶向的基因编辑系统，其特征在于其中包括： a. 线粒体靶向的DNA核酸酶， b. 线粒体革E1向的sgRNA， c. 线粒体靶向的RNA修复模板。2. 如权利要求1所述的线粒体靶向的基因编辑系统，其特征在于所述的DNA核酸酶为 SpCas9、SaCas9、CPF1、ZFN、TALENs。3. 如权利要求1所述的线粒体靶向的基因编辑系统，其特征在于线粒体靶向的DNA核酸 酶的构建方法为：设计编码C0X8基因线粒体定位序列的互补寡核苷酸链，退火后连入 SpCas9的表达载体，得到C0X8MTS-SpCas9融合蛋白，启动子为CBh。4. 如权利要求1所述的线粒体革El向的基因编辑系统，其特征在于线粒体革El向的sgRNA构 建的sgRNA的方法为:设计包含线粒体定位的RNA信号与针对人源ND4基因的sgRNA的互补寡 核苷酸链，退火后连入sgRNA的表达载体，得到mitoRNA signal-ND4sgRNA融合序列，启动子 为U6。5. 如权利要求1所述的线粒体靶向的基因编辑系统，其特征在于线粒体靶向的RNA修复 模板的制作方法为:采用DNA合成的方式，将线粒体定位的RNA信号与带有HA标签序列的人 源ND4修复模板融合得到mitoRNA signal-ND4-HA序列，酶切连接进入U6表达载体。6. -种线粒体靶向的基因编辑方法，其特征在于采用权利要求1~5任一所述的基因编 辑系统，将线粒体靶向的DNA核酸酶、线粒体靶向的sgRNA和线粒体靶向的RNA模板定位至线 粒体中。7. 如权利要求6所述的基因编辑方法，其特征在于采用Lipofectamine 3000转染试剂 将线粒体定位的DNA核酸酶、线粒体定位的sgRNA和RNA修复模板的表达载体共转染入293 细胞系，37度二氧化碳培养箱培养48小时。提取细胞基因组DNA，采用HA特异性的正向引物 和人源ND4特异性的反向引物进行PCR。
【专利摘要】本发明涉及一种线粒体靶向的基因编辑系统及方法，线粒体靶向的基因编辑系统包括：a.线粒体靶向的DNA核酸酶，b.线粒体靶向的sgRNA，c.线粒体靶向的RNA修复模板。基因编辑方法为：采用上述基因编辑系统，将线粒体靶向的DNA核酸酶、线粒体靶向的sgRNA和线粒体靶向的RNA模板定位至线粒体中。本发明利用序列特异性的核酸酶在靶位点处或附近制造一个DNA双链缺口(DSBs)，通过RNA模板实现了靶位点处的同源重组修复。
【IPC分类】C12N15/88
【公开号】CN105602993
【申请号】CN201610035146
【发明人】程田林, 田子仇
【申请人】上海赛墨生物技术有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月19日