核酸扩增反应装置和核酸扩增方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种核酸扩增反应装置和核酸扩增方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着基因利用技术的发展，基因诊断、基因治疗等利用基因的医疗受到瞩 目，除此之外，在农业、畜牧业领域也开发出多种将基因用于品种鉴别、品种改良的方法。作 为用于利用基因的技术，PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)法等核酸扩 增技术正在广泛普及。近年来，开发了能够用更短的时间得到核酸扩增反应产物的PCR装 置（例如，专利文献1)。核酸扩增反应用试剂的制备中，重要的是氯化镁浓度的设定，若低 浓度则收量减少，若高浓度则阻碍核酸扩增反应或可能成为非特异性扩增的原因。在众多 的已知种类的市售品中，进行核酸扩增的反应液中的氯化镁的推荐浓度为1. 5mM(例如，参 照非专利文献1、2)。
[0003] 现有技术文献
[0004] 专利文献
[0005] 专利文献1 :日本特开2012-115208
[0006] 非专利文献
[0007] 非专利文献1 :东洋纺株式会社Lifescience事业部，PCR相关故障分析的网 http://www. toyobo. co. jp/seihin/xr/lifescience/products/product/jisshirei/ archives/2008/04/post_21. html
[0008] 非专利文献2 :Life technologies公司，TaqDNA聚合酶和PlatinumTaq抗体的说 明书，6 页，http://tools. lifetechnologies. com/content/sfs/productnotes/f_050711_ taq-ts-tl-mkt-hl. pdf
【发明内容】
[0009] 发明人在使用了上述的PCR装置的核酸扩增反应中，发现如果缩短反应时间，特 别是缩短退火时间或退火和延伸时间，则与反应时间长的情况相比得不到足够量的核酸扩 增反应产物。因此本发明的课题在于提供一种即使反应时间短也能够得到足够量的核酸扩 增反应产物的核酸扩增反应装置和核酸扩增方法。
[0010] 本发明是为了解决上述课题中的至少一部分而进行的，能够以以下方式实现。
[0011] 本发明的一个实施方式是一种核酸扩增反应装置，包含：安装部，可安装填充有核 酸扩增反应液和比重小于核酸扩增反应液且不与核酸扩增反应液混合的液体的核酸扩增 反应容器；第1加热部，将核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度；第2加热部，将 核酸扩增反应容器的第2区域加热到第2温度；驱动机构，对第1配置和第2配置进行切 换，其中，上述第1配置为第1区域在重力作用的方向位于第2区域的下方，上述第2配置 为第2区域在重力作用的方向位于第1区域的下方；并且，核酸扩增反应液的镁离子浓度为 1. 8mM~9. OmM。核酸扩增反应液的镁离子浓度可以为2. OmM~7. 5mM。核酸扩增反应装置 进一步具有控制驱动机构的控制部，控制部保持上述第1配置的时间可以为4. 5秒以下，保 持上述第2配置的时间可以为18秒以下。控制部保持上述第1配置的时间可以为4秒以 下。控制部保持上述第2配置的时间可以为6秒以下。
[0012] 本发明的另一实施方式是一种核酸扩增反应用筒，上述核酸扩增反应用筒具备： 管、核酸扩增反应用容器和柱塞，其中，上述管在其内部依次具备由第1油构成的第1塞子、 由不与油混合的、对结合有核酸的核酸结合性固相载体进行清洗的清洗液构成的第2塞 子、由第2油构成的第3塞子、由不与油混合的、从结合有核酸的核酸结合性固相载体溶出 上述核酸的溶出液构成的第4塞子、由第3油构成的第5塞子、由不与油混合的、进行核酸 扩增反应的核酸扩增反应液构成的第6塞子、由第4油构成的第7塞子，上述核酸扩增反应 用容器与管的第7塞子侧连通，且包含油，上述柱塞安装于管的第1塞子侧的开口部，从管 的第7塞子侧向核酸扩增反应用容器推出液体，并且，溶出液和核酸扩增反应液的混合液 的镁离子浓度为1. 8mM~9. OmM。
[0013] 本发明的另一实施方式是一种核酸扩增反应用筒，上述核酸扩增反应用筒具备 管、核酸扩增反应容器和柱塞，上述管在其内部依次具备由第1油构成的第1塞子；由不与 油混合的、对结合有核酸的核酸结合性固相载体进行清洗的清洗液构成的第2塞子；由第 2油构成的第3塞子、由不与油混合的、从结合有核酸的核酸结合性固相载体溶出上述核酸 的溶出液构成的第4塞子；由第3油构成的第5塞子；上述核酸扩增反应用容器与管的第5 塞子侧连通，且包含油，上述柱塞安装于管的第1塞子侧的开口部，从管的第5塞子侧向核 酸扩增反应用容器推出液体，核酸扩增反应用容器包含由不与油混合的、进行核酸扩增反 应的核酸扩增反应液形成的液滴，并且，溶出液和核酸扩增反应液的混合液的镁离子浓度 为 1. 8mM ~9. OmM。
[0014] 本发明的另一实施方式是一种酸扩增反应用筒，上述酸扩增反应用筒具备：管、核 酸扩增反应用容器和柱塞，上述管在其内部依次具备由第1油构成的第1塞子；由不与油混 合的、对结合有核酸的核酸结合性固相载体进行清洗的清洗液构成的第2塞子；由第2油构 成的第3塞子；由不与油混合的、从结合有核酸的核酸结合性固相载体溶出上述核酸的溶 出液构成的第4塞子；由第3油构成的第5塞子；上述核酸扩增反应用容器与管的第5塞子 侧连通，且包含油，上述柱塞安装于管的第1塞子侧的开口部，从管的第5塞子侧向上述核 酸扩增反应用容器推出液体，并且，溶出液的镁离子浓度为1. 8mM~9. OmM。
[0015] 本发明的另一实施方式是一种核酸扩增方法，上述核酸扩增方法包含如下工序： 将核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度的工序，上述核酸扩增反应容器填充有核 酸扩增反应液和比重小于核酸扩增反应液且不与核酸扩增反应液混合的液体；将核酸扩增 反应容器的第2区域加热到比上述第1温度低的第2温度的工序；在第1配置保持第1时 间，使核酸扩增反应液在第1区域移动的工序，上述第1配置为第1区域在重力作用的方向 位于第2区域的下向；在第2配置保持第2时间，使核酸扩增反应液在第2区域移动的工 序，第2区域在重力作用的方向位于第1区域的下方；并且，核酸扩增反应液的镁离子浓度 为1. 8mM~9. OmM。第1时间可以为4. 5秒以下，第2时间可以为18秒以下。
[0016] 本发明的又一实施方式是一种核酸扩增方法，该核酸扩增方法进行规定次数的循 环，上述循环包括如下工序：将核酸扩增反应液在不与核酸扩增反应液混合的液体的第1 温度的第1区域中保持4. 5秒以下的时间的工序；在比第1温度低的第2温度的第2区域 中使核酸扩增反应液移动的工序；将核酸扩增反应液在第2区域中保持18秒以下的时间的 工序；并且，核酸扩增反应液的镁离子浓度为1. 8mM~9. OmM。
[0017] 根据本发明，能够提供一种新的核酸扩增反应装置和核酸扩增方法。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明的一个实施方式中的核酸扩增反应容器的截面图。g表示重力的方 向。
[0019] 图2是本发明的一个实施方式涉及的升降式PCR装置的立体图。（A)表示关闭盖 的状态，（B)表示打开盖的状态。
[0020] 图3是本发明的一个实施方式涉及的升降式PCR装置的主体的分解立体图。
[0021] 图4是示意地表示本发明的一个实施方式涉及的升降式PCR装置的主体的沿图 2㈧的A-A线的截面的截面图。㈧表示第1配置，（B)表示第2配置。
[0022] 图5是本发明的一个实施方式涉及的筒的说明图。
[0023] 图6是表示镁离子浓度与核酸扩增反应产物量的关系的图。
[0024] 图7是表示镁离子浓度与核酸扩增反应产物量的关系的图。
[0025] 图8是表示钾离子浓度与核酸扩增反应产物量的关系的图。
[0026] 图9是表示钾离子浓度与核酸扩增反应产物量的关系的图。
[0027] 图10是表示镁离子浓度与核酸扩增反应产物量的关系的图。
[0028] 图11是表示镁离子浓度与核酸扩增反应产物量的关系的图。
[0029] 图12是表示核酸扩增反应液中的镁离子浓度为5mM时的本发明的实施例和比较 例中的有无特异性扩增产物和非特异性扩增产物的图。
[0030] 图13是表示核酸扩增反应液中的镁离子浓度为5mM时的本发明的实施例和比较 例中的有无特异性扩增产物和非特异性扩增产物的图。
【具体实施方式】
[0031] 本发明的目的、特征、优点及其构思，通过本说明书的记载对本领域技术人员而言 是明确的，根据本说明书的记载，只要是本领域技术人员，就能容易地再现本发明。以下记 载的发明的实施方式和具体的实施例等表示本发明优选的实施方式，是用于例示或说明而 示出的，本发明不限于这些。对本领域技术人员而言，可以确定在本说明书中公开的本发明 的意图和范围内，基于本说明书的记载，可以进行各种改变和修饰。
[0032] (1)核酸扩增反应容器
[0033] 本发明的方法中使用的核酸扩增反应容器包含反应液和与反应液比重不同而发 生相分离的液体，且具有密闭了的容器，反应液为液滴状，液体包含油和添加剂。
[0034] 图1是核酸扩增反应容器100的截面图。图1表示在核酸扩增反应容器装入了反 应液的状态。
[0035] 本发明中使用的核酸扩增反应容器100包括容器150和密封部120而构成。核酸 扩增反应容器100的大小、形状没有特别限定，例如，可以考虑不与反应液140混合的液体 130的量、导热系数、容器150和密封部120的形状或操作的容易度中的至少一个而进行设 计。
[0036] 核酸扩增反应容器100的容器150可以由透明的材质形成。因此，可以从核酸扩 增反应容器100的外部对容器150内的反应液140的移动进行观察，或者可以用于实时荧 光定量PCR等从容器150的外部进行测定等的用途。应予说明，本说明书中所说的"透明" 的情况是指能够确保可从容器150的外部观察容器150内的反应液140的程度的可视性， 只要满足该条件，可以不必使核酸扩增反应容器100的整体为透明。
[0037] 核酸扩增反应容器100的用途没有特别限定，例如用于实时荧光定量PCR这样的 伴有荧光测定的用途时，容器150优选由自发荧光小的材质形成。容器150优选为可耐受 PCR中的加热的材质。而且，容器150的材质优选为对核酸、蛋白质的吸附少且不阻碍由聚 合酶等引起的酶反应的材质。作为满足这些条件的材质，没有特别限定，例如，可以为聚丙 烯、聚乙烯、环烯烃聚合物（例如，ΖΕ0ΝΕΧ(注册商标）480R)、耐热玻璃（例如PYREX(注册 商标）玻璃）等或它们的复合材料，优选聚丙烯。
[0038] 在图1所示的核酸扩增反应容器100中，容器150形成为圆筒状，中心轴方向（图 1中的上下方向）为长边方向。这里使用的容器150优选为管，也可以为小型离心用管、设 计成PCR用的管，但通过具有长边方向，即为细长的形状，从而例如使用后述的升降型的热 循环仪，以在容器150内的液体130中形成温度不同的区域的方式对核酸扩增反应容器100 进行温度控制时，易于增加不同的区域之间的距离。由此，易于对应容器150内的每个区 域，将液体130控制为不同的温度，因此，能够实现适于PCR的热循环。应予说明，升降型的 热循环仪是通过在充满容器150的液体中形成至少2个温度区域，使与液体发生相分离的 反应液140在这些温度区域间往返移动而实现热循环的装置。
[0039] 容器150的形状只要具有长边方向，就没有特别限定，用于升降型PCR装置时，在 大致圆筒形状中内径D与长边方向的长度L之比优选为1:5~1. 5:20的范围。而且，内径 D更优选为1. 5~2mm，长度L更优选为10~20mm〇
[0040] 容器150具有开口部和密封开口部的密封部120,容器150中含有反应液140和与 反应液140比重不同且发生相分离的液体130。通过密封部120密封