的组成：MgCl2:25mM，Tris-HCl (PH9. 0) :250mM，KC1:125mM
[0171] 终浓度：MgCl2:迦i，Tris-HCl (PH9. 0) : 50mM, KC1:25mM
[0172] 反应液1与反应液2的区别仅为是否包含人总RNA。人总RNA的量如图12中记载 的泳道⑵、（3)、⑷的说明所记载。应予说明，引物和探针的序列使用与实施例1相同的 序列。
[0173] RT-PCR反应条件如下。
[0174] (比较例的PCR装置）
[0175] 逆转录（RT)反应：50°C 30分钟
[0176] 逆转录酶失活反应：98°C 2分钟
[0177] 热循环：按以下的条件进行50次。
[0178] 98°C 15 秒 _55°C 30 秒
[0179] (实施例的升降式PCR装置）
[0180] 逆转录（RT)反应：50°C 60秒
[0181] 逆转录酶失活反应：98°C 10秒
[0182] 热循环：按以下的条件进行50次。
[0183] 98Γ 4 秒 _6(TC 6 秒
[0184] 换句话说，该试验中，因为扩增对象的核酸为InfA的RNA，反应液2包含人总RNA， 所以对在容易引起非特异性扩增的条件下进行的扩增产物进行电泳，将结果示于图12。
[0185] 图12中，比较例和实施例的泳道⑴为反应液1，换句话说，是不包含人总RNA的 反应液的扩增产物的泳道，泳道（2)、（3)、（4)为反应液2,换句话说是包含人总RNA的反应 液。
[0186] 首先，如果对实施例和比较例的泳道（1)进行比较，则比较例中产生相当多的非 特异性扩增产物，相对于此，实施例中，主要发生目标DNA的扩增，几乎不产生非特异性扩 增产物。
[0187] 另外，比较例泳道（2)中，发生了不能检测到目标DNA的扩增的程度的非特异性扩 增。另一方面，实施例泳道（2)~（4)均得到与不包含人总RNA的反应液1的情况相同的 结果，甚至在与比较例相比包含更多的人总RNA的反应液2中进行PCR的泳道（4)中，也几 乎确认不到非特异性扩增。
[0188] <实施例6 >多重PCR中的非特异性扩增的有无
[0189] 从具有以下组成的反应液1和2取出1. 6 yL，在升降式PCR装置中进行PCR反应。
[0190] (反应液1)
[0191]
[0192] ※5X 缓冲液的组成：MgCl2:25mM，Tris-HCl (ΡΗ9· 0) :250mM，KC1:125mM
[0193] 终浓度：MgCl2:迦1，Tris-HCl (PH9. 0) : 50mM, KC1:25mM
[0194] (反应液2)
[0195]
[0196] ※5X 缓冲液的组成：MgCl2:25mM，Tris-HCl (ΡΗ9· 0) :250mM，KC1:125mM
[0197] 终浓度：MgCl2:迦i，Tris-HCl (PH9. 0) : 50mM, KC1:25mM
[0198] 反应液1中，模板为InfA的质粒DNA，包含InfA扩增用引物对，而且包含与InfB 的质粒DNA结合的引物对。与此相对，反应液2不包含InfB用的引物对，除此以外，是与反 应液1相同的组成。
[0199] 对于引物和探针的序列，InfA使用与实施例1相同的序列，InfB使用以下序列。
[0200] (InfB 引物对）
[0201] InfB 正向引物：5' -TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG-3'（序列号 4)
[0202] InfB 反向引物：5' -CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3'（序列号 5)
[0203] 反应条件如下。
[0204] 热启动反应：98°C 10秒
[0205] 热循环：按以下的条件进行50次。
[0206] 高速条件（实施例）：98°C 4秒-60°〇6秒
[0207] 标准条件（比较例）：98°C 5秒-60°C 20秒
[0208] 对含有扩增产物的液体进行电泳，将结果示于图13。
[0209] 图13中，比较例和实施例的泳道（1)是流过包含InfB用引物对的反应液1的泳 道，泳道（2)是流过不包含InfB用引物对的反应液2的泳道。
[0210] 由图13可知，比较例中，泳道⑴可看到非特异性扩增产物，另一方面，实施例1 的泳道（1)中主要可确认特异性扩增产物。这样，PCR反应时间短的一方不易发生非特异 性扩增。
[0211] 符号说明
[0212] L···升降式PCR装置，10···主体，11···安装部，12···第1加热部，12a…第1加热器， 12b…第1加热块，13…第2加热部，13a···第2加热器，13b···第2加热块，14···隔离件，15… 导线，16···凸缘，17···底板，19···固定板，20···驱动机构，50···盖，51···固定部，100···核酸扩 增反应容器或核酸扩增反应用管，110…流路，111…第1区域，112…第2区域，120…密封 部，130…液体，140…核酸扩增反应液，150…容器，201…筒，203…罐，203B…变形部，205 - 适配体，209···筒主体，210···柱塞，211···筒状部，211A···安装台，212···棒状部，212A···密封， 213…肋，220…管，221…上注射筒，222…下注射筒，223…毛细管，225…固定爪，226…导 板，230…核酸扩增反应容器，231…密封形成部，232…油接受部，233…阶梯部，235…流路 形成部，235A…底，244…第1油塞子，245…清洗液塞子，246…第2油塞子，247…溶出液塞 子，248…第3油塞子，249…核酸扩增反应液塞子，250···第4油塞子。
【主权项】
1. 一种核酸扩增反应装置，包含： 安装部，能够安装填充有核酸扩增反应液和比重小于所述核酸扩增反应液且不与所述 核酸扩增反应液混合的液体的核酸扩增反应容器； 第1加热部，将所述核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度； 第2加热部，将所述核酸扩增反应容器的第2区域加热到第2温度；和， 驱动机构，对第1配置和第2配置进行切换，其中，所述第1配置为所述第1区域在重 力作用的方向位于所述第2区域的下方，所述第2配置为所述第2区域在重力作用的方向 位于所述第1区域的下方； 并且，所述核酸扩增反应液的镁离子浓度为1. 8mM~9. OmM。2. 根据权利要求1所述的核酸扩增反应装置，其中，所述核酸扩增反应液的镁离子浓 度为 2. OmM ~7. 5mM。3. 根据权利要求1或2所述的核酸扩增反应装置，其中，进一步具有控制所述驱动机构 的控制部， 所述控制部的保持所述第1配置的时间为4. 5秒以下，保持所述第2配置的时间为18 秒以下。4. 根据权利要求3所述的核酸扩增反应装置，其中，所述控制部的保持所述第1配置的 时间为4秒以下。5. 根据权利要求3或4所述的核酸扩增反应装置，其中，所述控制部的保持所述第2配 置的时间为6秒以下。6. -种核酸扩增反应用筒，具备：管、核酸扩增反应用容器和柱塞，其中， 所述管在其内部依次具备： 由第1油构成的第1塞子； 由不与油混合的、对结合了核酸的核酸结合性固相载体进行清洗的清洗液构成的第2 塞子； 由第2油构成的第3塞子； 由不与油混合的、从结合了核酸的核酸结合性固相载体溶出所述核酸的溶出液构成的 第4塞子； 由第3油构成的第5塞子； 由不与油混合的、进行核酸扩增反应的核酸扩增反应液构成的第6塞子； 由第4油构成的第7塞子； 所述酸扩增反应用容器与所述管的第7塞子侧连通，且包含油， 所述柱塞安装于所述管的第1塞子侧的开口部，从管的第7塞子侧向所述核酸扩增反 应用容器推出液体， 并且，所述溶出液和所述核酸扩增反应液的混合液的镁离子浓度为1. 8mM~9. OmM。7. -种核酸扩增反应用筒，具备：管、核酸扩增反应用容器和柱塞，其中， 所述管在其内部依次具备： 由第1油构成的第1塞子， 由不与油混合的、对结合了核酸的核酸结合性固相载体进行清洗的清洗液构成的第2 塞子， 由第2油构成的第3塞子， 由不与油混合的、从结合了核酸的核酸结合性固相载体溶出所述核酸的溶出液构成的 第4塞子， 由第3油构成的第5塞子， 所述核酸扩增反应用容器与所述管的第5塞子侧连通，且包含油， 所述柱塞安装于所述管的第1塞子侧的开口部，从管的第5塞子侧向所述核酸扩增反 应用容器推出液体， 所述核酸扩增反应用容器包含由不与油混合的、进行核酸扩增反应的核酸扩增反应液 形成的液滴， 并且，所述溶出液和所述核酸扩增反应液的混合液的镁离子浓度为1. 8mM~9. OmM。8. -种核酸扩增反应用筒，具备：管、核酸扩增反应用容器和柱塞，所述管在其内部依 次具备： 由第1油构成的第1塞子， 由不与油混合的、对结合了核酸的核酸结合性固相载体进行清洗的清洗液构成的第2 塞子， 由第2油构成的第3塞子， 由不与油混合的、从结合了核酸的核酸结合性固相载体溶出所述核酸的溶出液构成的 第4塞子， 由第3油构成的第5塞子， 所述核酸扩增反应用容器与所述管的第5塞子侧连通，且包含油， 所述柱塞安装于所述管的第1塞子侧的开口部，从管的第5塞子侧向所述核酸扩增反 应用容器推出液体， 并且，所述溶出液的镁离子浓度为1. 8mM~9. OmM。9. 一种核酸扩增方法，包括如下工序： 将核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度的工序，其中，所述核酸扩增反应容器 填充有核酸扩增反应液和比重小于所述核酸扩增反应液且不与所述核酸扩增反应液混合 的液体； 将所述核酸扩增反应容器的第2区域加热到比所述第1温度低的第2温度的工序； 在所述第1区域在重力作用的方向位于所述第2区域的下方的第1配置保持第1时间， 使所述核酸扩增反应液移动到所述第1区域的工序； 在所述第2区域在重力作用的方向位于所述第1区域的下方的第2配置保持第2时间， 使所述核酸扩增反应液移动到所述第2区域的工序； 其中，所述核酸扩增反应液的镁离子浓度为1. 8mM~9. OmM。10. 根据权利要求9所述的核酸扩增方法，所述第1时间为4. 5秒以下，所述第2时间 为18秒以下。11. 一种核酸扩增方法，进行规定次数的循环，所述循环包括： 将核酸扩增反应液在不与所述核酸扩增反应液混合的液体的第1温度的第1区域中保 持4. 5秒以下的时间的工序， 在比第1温度低的第2温度的第2区域中使所述核酸扩增反应液移动的工序， 将所述核酸扩增反应液在所述第2区域中保持18秒以下的时间的工序， 并且，所述核酸扩增反应液的镁离子浓度为1. 8mM~9. OmM。
【专利摘要】本发明提供一种即使反应时间短也能够得到足够的核酸扩增反应产物的核酸扩增反应装置和核酸扩增方法。核酸扩增反应装置包含：安装部，可安装填充有核酸扩增反应液和比重小于核酸扩增反应液且不与核酸扩增反应液混合的液体的核酸扩增反应容器；第1加热部，将所述核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度；第2加热部，将所述核酸扩增反应容器的第2区域加热到第2温度；和驱动机构，对第1配置和第2配置进行切换，上述第1配置为第1区域在重力作用的方向位于第2区域的下方，上述第2配置为第2区域在重力作用的方向位于上述第1区域的下方，核酸扩增反应液的镁离子浓度为1.8mM～9.0mM。
【IPC分类】C12M1/00, C12N15/10, C12M1/38, C12Q1/68
【公开号】CN105624031
【申请号】CN201510795998
【发明人】上原雅行, 井手上公太郎, 花村雅人, 齐藤祐司, 山口明美
【申请人】精工爱普生株式会社
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2015年11月18日
【公告号】EP3023153A2, EP3023153A3, US20160145675