有机溶剂和离液物质。
[0092] 溶出液中含有的dNTP、盐的浓度是考虑经冷冻干燥的核酸扩增反应试剂中的 dNTP、盐的浓度而最终适于使用的酶的浓度即可，通常，dNTP可以为10~1000 μM，优选为 100~500 μΜ，C1可以为1~2000mM，优选为200~700mM，总离子浓度没有特别限定，可 以是高于50mM高的浓度，优选高于100mM的浓度，更优选高于120mM的浓度，进一步优选高 于150mM的浓度，更进一步优选高于200mM的浓度。上限优选500mM以下，更优选300mM以 下，进一步优选200mM以下。引物用寡核苷酸使用0.1~10 μΜ，优选使用0.1~ΙμΜ。若 BSA或明胶的浓度为lmg/mL以下，则反应阻碍抑制效果小，若为10mg/mL以上，则存在阻碍 逆转录反应或其后的酶反应的可能性，因此优选1~10mg/mL。使用明胶时，其来源可例示 牛皮、猪皮、牛骨，没有特别限定。明胶难以溶解时，可以加热使其溶解。
[0093] 在与管220连通的核酸扩增反应容器230中进行上述的热循环处理。核酸扩增反 应容器230用与上述的液体130相同的不与核酸扩增反应液混合的液体充满。溶出液塞子 247从管220被推到核酸扩增反应容器230中时，成为液滴状，成为液滴状的溶出液247沉 降。在核酸扩增反应容器230内沉降的溶出液247与核酸扩增反应容器230中的包含核酸 扩增反应试剂的核酸扩增反应液混合。核酸扩增反应容器230中，可以含有经冷冻干燥的 核酸扩增反应试剂，被溶出液247溶解而成为核酸扩增反应液。
[0094] 作为另一实施方式，管220不仅包含第1油塞子244、清洗液塞子245、第2油塞子 246、溶出液塞子247、第3油塞子248,还可以在它们的下游包含核酸扩增反应液塞子和第 4油塞子。此时，溶出液和核酸扩增反应液混合的混合液被推到核酸扩增反应容器内。
[0095] 通过在核酸扩增反应容器230中形成有上述的加热部加热到第1温度的第1区域 和加热到比第1温度低的第2温度的第2区域，反复使筒101整体与其加热部一起上下翻 转，从而使液滴状的核酸扩增反应液在第1与第2区域之间移动，实施热循环处理，核酸扩 增。
[0096] 用于使与筒连通的核酸扩增反应容器如上所述地旋转而进行核酸扩增反应的装 置结构，没有特别限定。例如，可以利用上述的日本特开2014-176304中记载的装置构成来 旋转核酸扩增反应容器进行本发明的热循环处理。
[0097] 使用上述例示的筒时，可以使溶出液和核酸扩增反应液的混合液的镁离子浓度为 1. 8mM ~9. OmM，优选为 2. OmM ~7. 5mM。
[0098] 作为又一实施方式，溶出液塞子247还包含上述的核酸扩增反应试剂，在被推到 核酸扩增反应容器230中而成为液滴状的溶出液247中可以进行上述的热循环处理。换句 话说，本方式中，核酸扩增反应容器中可以不包含核酸扩增反应试剂，溶出液的镁离子浓度 可以为L 8mM~9. OmM，优选为2. OmM~L 5mM。
[0099] 实施例
[0100] 以下，根据实施例进一步详细说明本发明，本发明不限定于实施例。
[0101] <实施例1 >以往的PCR装置和本发明涉及的PCR装置中的镁离子浓度与核酸扩 增反应效率的关系
[0102] (1)使用以往的PCR装置的情况（比较例）
[0103] 作为比较例，使用Life Technologies公司的StepOnePlus作为PCR装置，模板使 用A型流感病毒（以下，均记为InfA)的质粒DNA进行核酸扩增反应（PCR)。这里，使用退 火温度与延伸反应温度相同的往返PCR法。
[0104] 制备核酸扩增反应液内的镁离子浓度为1. 5mM的反应液，作为反应液1，制备核酸 扩增反应液内的镁离子浓度为5. OmM的反应液，作为反应液2。
[0105] 反应液1和2的组成如下。核酸扩增反应使用10 μ L的核酸扩增反应液，下述的 各成分的液量表示每10 μ L反应液的液量。
[0106] (反应液1)
[0107]
[0108] ※5X 缓冲液的组成：MgCl2:7. 5mM、KCl:125mM、Tris-HCl(PH9. 0) :250mM
[0109] ※反应液中的终浓度：MgCL:l. 5mM, KC1:25mM, Tris-HCl (PH9. 0) : 50mM
[0110] (反应液2)
[0111]
[0112]
[0113] ※5X 缓冲液的组成：MgCl2:25mM，KCl:125mM，Tris-HC1(PH9. 0) :250mM
[0114] 终浓度：MgCl2 :迦i，KC1:25mM, Tris-HCl (PH9. 0) : 50mM
[0115] 另外，引物和探针的序列如下。
[0116] (引物序列）
[0117] InfA 正向引物：5' -GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3'（序列号 1)
[0118] InfA 反向引物：5' -AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3'（序列号 2)
[0119] (探针序列）
[0120] InfA TaqMan-探针：
[0121] 5' FAM-CACAAATCCTAAAATTCCCT-BHQ1-3'（序列号 3)
[0122] PCR条件如下。
[0123] 热启动条件：98°C 2分钟
[0124] 热循环条件：热变性98°C 15秒
[0125] 退火和延伸55 °C 30秒
[0126] 50 循环
[0127] 对各反应液各进行2次PCR。将结果示于图6。纵轴的荧光亮度越高，表示得到更 多的核酸扩增反应产物。
[0128] 由图6可知，比较例的PCR装置中，反应液中的镁离子浓度为1. 5mM的情况和 5. OmM的情况下，核酸扩增反应效率是同等的。这里，就反应效率的高低而言，相对于循环数 的荧光亮度越高，反应效率越高，相对于循环数的荧光亮度越低，反应效率越低。
[0129] (2)使用本发明涉及的升降式PCR装置的情况（实施例）
[0130] 使用上述的升降式PCR装置代替上述比较例中使用的PCR装置，准备核酸扩增反 应液中的镁离子浓度为1. OmM、1. 5mM、2. OmM、5. OmM、7. 5mM、或10.0 mM的6种反应液，以上述 的InfA的质粒为模板，使用上述的引物和探针进行PCR。
[0131] 反应液的组成如下。
[0132]
[0133] ※5X 缓冲液的组成：MgCl2:5. 0mM、7. 5mM、10mM、25mM、37. 5mM 或 50.0 mM， KC1:125mM, Tris-HCl(PH9. 0):250mM
[0134] ※终浓度：MgCL·:!. OmM、l. 5mM、2. 0mM、5. 0mM、7. 5mM 或 10.0 mM, KCl:25mM, Tris-HCl(PH9. 0):50mM
[0135] PCR条件如下。
[0136] 热启动条件：98°C 10秒
[0137] 热循环条件：98 °C 3秒-60 °C 6秒
[0138] 50 循环
[0139] 将结果示于图7。镁离子浓度为2. OmM、5. OmM和7. 5mM时，反应效率特别高。另一 方面，1. OmM和10.0 mM时几乎看不到扩增。
[0140] 换句话说，PCR反应时间短时，在镁离子浓度高于作为推荐浓度的1. 5mM的浓度 下，与1. 5mM的情况相比存在反应效率提高的浓度范围。
[0141] <实施例2 >本发明涉及的PCR装置中的镁离子浓度和钾离子浓度与核酸扩增反 应效率的关系
[0142] (1)镁离子浓度为1. 5mM时的钾离子浓度的影响
[0143] 实施例1中，使核酸扩增反应液中的镁离子浓度为1. 5mM，使核酸扩增反应液中的 KC1浓度为0mM、25mM或65mM，核酸扩增反应使用1. 6 μ L的反应液，除此之外，与实施例1 同样地进行核酸扩增反应。
[0144] 各核酸扩增反应液的组成如下。
[0145]
[0146] ※5X 缓冲液的组成：KC1:OmM、125πΜ 或 325mM，MgCl2:25mM，Tris-HCl (ΡΗ9· 0) : 250mM
[0147] 终浓度：KCl:0mM、25mM 或 65mM，MgCL:5. OmM, Tris-HCl (PH9. 0) :50mM
[0148] 将结果示于图8。KC1的浓度不影响反应效率。
[0149] (2)镁离子浓度为5. OmM时的钾离子浓度的影响
[0150] 实施例1中，使核酸扩增反应液中的镁离子浓度为5. OmM，使核酸扩增反应液中的 KC1浓度为OmM、10mM、25mM、50mM或65mM，除此之外，与实施例1同样地进行核酸扩增反应。
[0151] 各核酸扩增反应液的组成如下。
[0152]
[0153] ※旦父缓冲液的组成：KCl:ChM、5ChM、12&M、25ChMS32&M，MgCl2:7.&M，TriH_.0):250mM
[0154] 终浓度：1((：1:〇1111、1〇1111、251111、5〇1111或651111，MgCL:l. 5mM, Tris-HCl (PH9. 0) :50mM
[0155] 将结果示于图9。KC1的浓度即使在镁离子浓度为5. OmM的情况下，也不对反应效 率造成影响。另外，无论KC1的浓度如何，镁离子浓度为5. OmM的情况与1. 5mM的情况相比 反应效率高。
[0156] <实施例3 >本发明涉及的PCR装置中的镁离子浓度与核酸扩增反应效率的关系
[0157] 实施例1 (2)中，将模板变为InfB(B型流感病毒）的质粒，使镁离子浓度为1. 5mM 或5. OmM，除此之外，与实施例1同样地进行PCR。将结果示于图10。
[0158] 由图10可知，以InfB的质粒为模板的情况下，也得到了与以InfA的质粒为模板 的情况相同的结果，换句话说，得到镁离子浓度为5. OmM的情况与1. 5mM的情况相比反应效 率更好的结果。也就是说，本发明无论核酸扩增反应的模板的种类如何，都能够提高反应效 率。
[0159] <实施例4 >改变聚合酶的情况
[0160] 实施例1中，将聚合酶改为GeneTaqNT，使核酸扩增反应液中的镁离子浓度为 1. 5mM或5. OmM，除此之外，与实施例1同样地进行RT-PCR。将结果示于图11。
[0161] 由图11可知，使DNA聚合酶为GeneTaqNT (株式会社Nippon Gene)的情况下，得 到了与使用PlatinumTaq的情况相同的结果，换句话说，得到镁离子浓度为5. OmM的情况与 1. 5mM的情况相比反应效率较好这样的结果。也就是说，本发明无论DNA聚合酶的种类如何 都能够提尚反应效率。
[0162] <实施例5 >单一 PCR中的非特异性扩增反应的有无
[0163] 将具有以下组成的反应液在上述的比较例的PCR装置中各使用10 yL，在实施例 的升降式PCR装置中各使用1. 6 μ L，进行RT-PCR反应。
[0164]
[0165]
[0166] ※5X 缓冲液的组成：MgCl2:25mM，Tris-HCl (ΡΗ9· 0) :250mM，KC1:125mM
[0167] 终浓度：MgCl2:迦i，Tris-HCl (PH9. 0) : 50mM, KC1:25mM
[0168] (反应液2)
[0169]
[0170] ※5X 缓冲液