核酸扩增反应装置和核酸扩增方法_2

文档序号:9858982阅读:来源:国知局
开口部时,优选在容器 150内不残留空气。这是因为如果在容器150内残留气泡,则妨碍反应液140的移动。密封 部120可以由与容器150相同的材质形成。密封部120的结构只要是能够密闭容器150的 结构即可,例如,可以为螺帽、栓、嵌入等结构。在图1中,密封部120为螺帽的结构。
[0041] 核酸扩增反应液140可以含有核酸扩增反应用试剂和扩增对象的靶核酸。作为靶 核酸,例如,可举出由血液、尿、唾液、骨髓液、组织等被检测物制备的DNA,或将由这些被检 测物制备的RNA进行逆转录而成的cDNA等。核酸扩增反应用试剂可以含有用于扩增靶核 酸的引物对、缓冲液、聚合酶、dNTP、MgCl 2和用于对靶核酸的扩增产物进行检测的荧光标记 等。DNA聚合酶没有特别限定,优选耐热性的酶、PCR用酶,例如,Taq聚合酶、Tfi聚合酶、 Tth聚合酶或者它们的改良型等大量市售品,优选进行热启动的DNA聚合酶。只要dNTP的浓 度为适合于所使用的酶的浓度即可,通常可以将dNTP设为10~1000 μM,优选设为100~ 500 μ Μ〇
[0042] 反应液140中的镁离子(Mg2+)的浓度优选为1. 8mM~9. OmM,更优选为2. OmM~ 7. 5mM。Mg2+的来源没有特别限定,可以来自氯化镁,也可以来自硫酸镁,优选Mg2+来自氯化 镁。
[0043] 反应液140中的总离子浓度没有特别限定,可以是高于50mM的浓度,优选高于 lOOmM高的浓度,更优选高于120mM的浓度,进一步优选高于150mM的浓度,更进一步优选高 于200mM的浓度。上限优选500mM以下,更优选300mM以下,进一步优选200mM以下。引物 用寡核苷酸分别使用〇. 1~10 μΜ,优选使用0. 1~1 μΜ。
[0044] 反应液140还可以含有表面活性剂。表面活性剂没有特别限定,可例示ΝΡ40、 TritonX-100、Tween20等。表面活性剂的浓度没有特别限定,优选不阻碍核酸扩增反应的浓 度,可以为〇· 001 %~〇· 1 %以下,优选为〇· 002 %~0· 02 %,最优选为(λ 005 %~(λ 01 %。 表面活性剂可以从上述的酶的储液带入,也可以与上述的酶的储液相独立地将表面活性剂 溶液添加到反应液140。
[0045] 通过作为液体130使用不与反应液140混合的物质,将反应液140加入容器150 时,反应液140与液体130发生相分离,因此在液体130中可使反应液140形成为液滴状。 这样,反应液140在液体130中能够以液滴状保持。
[0046] 液体130优选比重小于反应液140的液体。此时,将反应液140加入液体130中 时,由于反应液140的液滴的比重大于液体130,所以由于重力作用而向重力作用的方向移 动。另外,液体130也可以为比重大于反应液140的液体。此时,反应液140的液滴比重小 于液体130,因此由于重力作用而朝向与重力作用的方向相反的方向移动。
[0047] 液体130优选含有油,例如,可使用硅油或矿物油。这里,有机硅表示具有硅氧键 作为主骨架的低聚物或聚合物。本说明书中,将有机硅中的在热循环处理中使用的温度带 中为液体状态的物质特别称为硅油。另外,在本说明书中,将由石油精制且在热循环处理中 使用的温度带中为液体的物质称为矿物油。这些油对热的稳定性高,例如还易于得到粘度 为5Χ 103Nsm 2以下的制品,因此适用于升降型的PCR装置。
[0048] 作为硅油,可例不 Shinetsu Silicone 公司制的 KF-96L-0· 65cs、KF_96L_lcs、 KF-96L-2cs、KF-96L-5cs、Dow Corning Toray 公司制的 SH200 C FLUID 5 CS、或者 Momentive Performance Materials Japan 合同会社制的 TSF451-5A、TSF451_10 等二甲基 硅油。作为矿物油,可例示含有碳原子数14~20左右的烷烃作为主成分的矿物油。即,例 示出正十四烷、正十五烷、正十六烷、正十七烷、正十八烷、正十九烷、正二十四烷。
[0049] 油的粘性没有特别限定,优选为90cs以下,更优选为70cs以下,进一步优选为 50cs以下,更进一步优选为30cs以下,这样,优选粘性小的油,由此,如后所述反应液沉降 时,能够更顺畅地沉降。
[0050] 液体130可以含有添加剂。作为添加剂,例如,可以使用X-22-160AS、X-22-3701E、 KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、KF-6017、KF-8005(以上,Shinetsu Silicone 公 司)等改性硅油,SR1000、SS4230、SS4267、YR3370(以上,Momentiv公司)等有机硅树 月旨,XS66-C1191 (Momentive社)等氟改性有机硅树脂等,除此之外,TSF4703、TSF4708、 XF42-C5196、XF42-C5197(以上,Momentive公司)等改性硅油。添加剂的浓度没有特别限 定,可以考虑容器的结构、材质、形状等来决定。例如,优选为1% (v/v)~50% (v/v),更优 选为 2% (v/v)~20% (v/v),进一步优选为 5% (v/v)。
[0051] (2)核酸扩增反应装置的装置构成
[0052] 在本实施方式中,作为进行核酸扩增反应的核酸扩增反应容器,使用管型的核酸 扩增反应用管100。以下,将PCR作为核酸扩增反应的一个例子,对适于核酸扩增反应用管 100的升降式核酸扩增反应装置(以下,均称为升降式PCR装置)的一个例子进行详细说 明。
[0053] 图2表示升降式PCR装置1的一个例子。图2 (A)为关闭升降式PCR装置1的盖 50的状态,图2(B)为打开升降式PCR装置1的盖50的状态,表示在安装部11安装有核酸 扩增反应用管100的状态。图3是实施方式涉及的升降式PCR装置1中的主体10的分解 立体图。图4是示意地表示实施方式涉及的升降式PCR装置1中的主体10的沿图2(A)的 A-A线的截面的截面图。
[0054] 如图2 (A)所示,该升降式PCR装置1包含主体10和驱动机构20。如图3所示, 主体10包含安装部11、第1加热部12和第2加热部13。在第1加热部12与第2加热部 13之间设有隔离件14。在本实施方式的主体10中,第1加热部12配置于底板17 -侧,第 2加热部13配置于盖50 -侧。在本实施方式的主体10中,第1加热部12、第2加热部13 和隔离件14被固定于凸缘16、底板17和固定板19。
[0055] 安装部11是安装后述的核酸扩增反应用管100的结构。如图2(B)和图3所示, 本实施方式的安装部11是以插入方式安装核酸扩增反应用管100的插槽结构,成为核酸扩 增反应用管100插入贯通第1加热部12的第1加热块12b、隔离件14和第2加热部13的 第2加热块13b的孔的结构。安装部11的数量可以为多个,在图2(B)的例子中,在主体10 中设有20个安装部11。
[0056] 该升降式PCR装置1包含将核酸扩增反应用管100相对于第1加热部12和第2 加热部13保持在规定的位置的结构。更具体而言,如图4所示,可以将构成后述的核酸扩 增反应用管100的流路110的第1区域111通过第1加热部12进行加热,可以将构成后述 的核酸扩增反应用管100的流路110的第2区域112通过第2加热部13进行加热。本实 施方式中,决定核酸扩增反应用管100的位置的结构为底板17,如图4 (A)所示,通过将核酸 扩增反应用管100插入直到与底板17接触的位置,能够相对于第1加热部12和第2加热 部13将核酸扩增反应用管100保持在规定的位置。
[0057] 第1加热部12在安装部11安装有核酸扩增反应用管100时,将后述的核酸扩增 反应用管100的第1区域111的温度加热到第1温度。在图4㈧所示的例子中,第1加热 部12在主体10中配置于对核酸扩增反应用管100的第1区域111进行加热的位置。
[0058] 第1加热部12可以包括产生热的机构和将产生的热传递给核酸扩增反应用管100 的部件。在图3所示的例子中,第1加热部12包括第1加热器12a和第1加热块12b。在 本实施方式中,第1加热器12a为筒式加热器(Cartridge heater),通过导线15与未图示 的外部电源连接。第1加热器12a插入到第1加热块12b,第1加热器12a发热从而对第1 加热块12b进行加热。第1加热块12b是将从第1加热器12a产生的热传递给核酸扩增反 应用管100的部件。在本实施方式中为铝制的块。
[0059] 在安装部11安装有核酸扩增反应用管100时,第2加热部13将核酸扩增反应用 管100的第2区域112加热到与第1温度不同的第2温度。在图4㈧所示的例子中,第2 加热部13在主体10中配置于对核酸扩增反应用管100的第2区域112进行加热的位置。 如图3所示,第2加热部13包括第2加热器13a和第2加热块13b。第2加热部13加热的 核酸扩增反应用管100的区域和加热的温度与第1加热部12不同,除此之外,与第1加热 部12相同。
[0060] 在本实施方式中,第1加热部12和第2加热部13的温度由未图示的温度传感器 和后述的控制部控制。第1加热部12和第2加热部13的温度优选以使核酸扩增反应用管 100被加热到所希望的温度进行设定。在本实施方式中,通过将第1加热部12控制为第1 温度,将第2加热部13控制为第2温度,能够将核酸扩增反应用管100的第1区域111加 热到第1温度,将核酸扩增反应用管100的第2区域112加热到第2温度。本实施方式中 的温度传感器为热电偶。
[0061] 驱动机构20是对安装部11、第1加热部12和第2加热部13进行控制的机构,由 此控制第1区域和第2区域的配置。在本实施方式中,驱动机构20包含未图示的马达和驱 动轴,驱动轴和主体10的凸缘16连接。本实施方式中的驱动轴相对于安装部11的长边方 向垂直地设置,马达动作时,主体10以驱动轴为旋转的轴旋转。
[0062] 本实施方式的升降式PCR装置1包含未图示的控制部。控制部对后述的第1温度、 第2温度、第1时间、第2时间和热循环的循环数中的至少一项进行控制。在控制部控制第 1时间或第2时间的情况下,通过控制部控制驱动机构20的动作,从而对将安装部11、第1 加热部12和第2加热部13被保持为规定的配置的时间进行控制。本发明的实施方式中,控 制部以如下方式控制驱动机构,即,将核酸扩增反应液140在第1温度的第1区域保持4. 5 秒以下的时间,优选保持4秒以下的时间(第1时间),在第2温度的第2区域使核酸扩增 反应液140移动,接着在第2区域将核酸扩增反应液140保持18秒以下的时间,优选保持 12秒以下的时间,进一步优选保持6秒以下的时间(第2时间)。这里,第2温度低于第1 温度。即使对应控制的每个项目设置不同的机构,控制部也可以对全部项目一并进行控制, 本实施方式的升降式PCR装置1中的控制部为电子控制,全面控制上述项目。本实施方式 的控制部包含未图示的CPU等处理器和R0M(只读存储器,Read Only Memory)、RAM(随机 存储器,Random Access Memory)等存储装置。在存储装置中存储用于控制上述各项目的 各种程序、数据等。另外,存储装置具有暂时存储各种处理的处理中数据、处理结果等的工 作区域。
[0063] 如图3和图4⑷的例子所示,本实施方式的主体10在第1加热部12和第2加热 部13之间设有隔离件14。本实施方式的隔离件14是保持第1加热部12或第2加热部13 的部件。在本实施方式中,隔离件14为隔热材料,在图4(A)的例子中,安装部11贯通隔离 件14〇
[0064] 本实施方式的主体10包含固定板19。固定板19是保持安装部11、第1加热部12 和第2加热部13的部件。在图2(B)和图3所示的例子中,2张固定板19嵌合于凸缘16, 固定第1加热部12、第2加热部13和底板17。
[0065] 本实施方式的升降式PCR装置1包含盖50。在图2(A)和图4(A)的例子中,安装
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