表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域和纳米磁珠材料领域，具体是涉及表达特定重组蛋白 的功能化细菌磁颗粒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 细菌磁颗粒是趋磁细菌生产的一种磁性纳米颗粒，内核是Fe304晶体，外面有一层 磷脂生物膜包被，粒径在30-120nm之间。同一种趋磁细菌生产的细菌磁颗粒粒径大小和晶 体晶型基本一致，磁学性质均一，有天然生物膜包被，具有很好的水溶性质和胶体性质。此 外，因为细菌磁颗粒是生物来源，因此具有较好的生物相容性。细菌磁颗粒膜上带有大量的 氨基基团，可通过化学修饰和双功能偶联剂连接不同的功能大分子，如抗体，从而具有不同 的特殊功能。细菌磁颗粒最独特的地方在于它可以通过基因工程的方法在细菌磁颗粒膜上 表达特殊的蛋白质，功能性的靶蛋白可以在细菌磁颗粒上展示出来。
[0003] 重组蛋白A(rProtein A)来源是金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus Protein A，SPA)，SpA是葡球菌胞璧蛋白，具有独特的生物学活性，它能够与哺乳动物免疫球蛋白IgG 的Fc段特异结合。天然的SPA具有5个同源结构域(A-E)能与IgG结合，但结合强度有差别，其 中的B结构域和I gG的结合力较好。重组蛋白G (rPr〇 t e in G )来源是链球菌蛋白G (Streptococcus Protein G，SPG)，SPG是A、C和G群链球菌的胞璧蛋白，能和人以及多种哺 乳动物的IgG以及人血清白蛋白（HSA)结合。SPG同IgG的亲和力强，结合谱广，SPG分子中的C 结构域负责同IgG的Fc段结合。
[0004] 现有技术公开了利用偶联剂或交联剂分别将酶、抗体连接在细菌磁颗粒上，构建 磁性复合物，用于固定化酶或检测病原菌等有害物质;这些方法的构建都是直接将细菌磁 颗粒与上述物质偶联，而CN104278048公开了一种重组质粒，该质粒通过磁螺旋菌野生型菌 株MSR-1的基因组DNA为模板，通过带有(GLy 4Ser)3Linker的引物扩增得到生物素羧基载体 蛋白基因。现有技术公开的linker的氨基酸序列短，细菌磁颗粒膜蛋白与不同的抗体或蛋 白结合后，会产生两者的空间结构相互影响的技术问题。
[0005] 并且重组蛋白A和重组蛋白G最普遍的应用是原核表达后偶联到凝胶树脂或者磁 珠上用作免疫分析及纯化等用途。但现有技术中普遍存在着重组蛋白与磁珠或磁性颗粒结 合形成的颗粒与IgG的结合特异性差，负载IgG的载量低等技术问题。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种新的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁 颗粒，该功能化细菌磁颗粒通过引入一个较长的多肽链，从而克服了两种不同蛋白的空间 结构相互影响的技术问题，并且制备而成的功能化细菌磁颗粒与IgG的结合特异性强，负载 IgG的载量高。
[0007] 本发明具体技术方案如下：
[0008] 本发明提供一种表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，该功能化细菌磁颗粒的 结构物质由特定重组蛋白通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成;所述多肽链的氨 基酸残基为(AlamGlySer)n(GlyaSer)b(GlySerAlam)n，m = 2-5，n = 2-5，a = 2-5，b = 3-7〇
[0009] 进一步的改进，所述细菌磁颗粒膜蛋白基因为mamC或mamF。
[0010] 本发明提供的功能化细菌磁颗粒是由重组趋磁细菌合成，该重组趋磁细菌是通过 如下方法构建而成的：
[0011] a)构建细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
[0012] b)构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
[0013] c)将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入至I」步骤&制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建重组趋磁细菌MSR-1。
[0014] 进一步的改进，述多肽链的氨基酸残基为（AlamGlySer)n(GlyaSer)b (GlySerAlam)n，m=3，n = 3，a = 2_5，b = 3_7〇
[0015] 进一步的改进，a = 3，b = 5,多肽链的序列（如SEQ ID No.l所示）为5-GCAGCCGCTG GAAGCGCAGC CGCTGGAAGC GCAGCCGCTG GAAGCGGAGG TGGAAGCGGA GGTGGAAGCG GAGGTGGAAG CGGAGGTGGA AGCGGAGGTGGAAGCGGAAG CGCAGCCGCT GGAAGCGCAG CCGCTGGAAG CGCAGCCGCT- 3〇
[0016] 本发明通过提供的多肽链是一般柔性linker多肽长度的3倍;并且其两端增加了 刚性的Ala残基，以此用于稳定两个不同蛋白的空间结构，并且克服了两个蛋白之间存在着 相互影响的技术问题。
[0017] 进一步的改进，特定重组蛋白为特定重组蛋白A，该特定重组蛋白A为在重组蛋白A 的B结构域的氨基酸的基础上，将第29位Gly突变成Ala。
[0018] 优选地，特定重组蛋白A的序列（如SEQIDNo.2所示)是：5-GCCGACAATAAATTCAA CAAAGAACAA CAAAATGCGT TCTATGAAAT TTTACATTTA CCTAATTTAA CTGAAGAACA ACGTAATGGC TTCATCCAAA GCCTTAAAGA CGATCCTTCA GTGAGCAAAG AAATTTTAGC CGAAGCGAAA AAGCTAAACG ATGCCCAAGC ACCAAAA GGTTCA GGCGGAAGC GGCGGCGGAAGC GGAGGCTCA GGTAGC GCCGACA ATAAATTCAA CAAAGAACAA CAAAATGCTT TCTATGAAAT TTTACATTTA CCTAATTTAA CTGAAGAACA ACGTAATGGC TTCATCCAAA GCCTTAAAGA CGATCCTTCA GTGAGCAAAG AAATTTTAGC CGAAGCCAAA AAGCTAAATG ATGCGCAAGC GCCAAAA-3。
[0019] 将重组蛋白A的B结构域中第29位Gly突变成Ala可改良成Z结构域，可提高B结构域 的耐受性，具有结合IgG恒定区Fc段的高特异性。并且改良的Z结构域的寡聚体与IgG的结合 能力比重组蛋白A的B结构域或重组蛋白A要好。
[0020] 进一步的改进，所述特定重组蛋白为特定重组蛋白G，所述特定重组蛋白G为重组 蛋白G的C结构域二聚体。
[0021] 优选地，特定重组蛋白G的序列（如SEQIDNo.3所示）是：5-ACTTACAAACTTGT CATTAATGGT AAAACATTGA AAGGCGAAAC AACTACTAAA GCAGTCGACG CAGAAACTGC AGAAAAAGCC TTCAAACAAT ACGCTAACGA CAACGGTGTC GATGGTGTGT GGACTTATGA TGATGCGACT AAGACCTTTA CGGTCACTGA A GGTTCA GGCGGAAGC GGCGGCGGAAGC GGAGGCTCA GGTAGCGGC ACTT ACAAACTTGT CATTAATGGT AAAACATTGA AAGGCGAAAC AACTACTAAA GCAGTCGACG CAGAAACTGC AGAAAAAGCC TTCAAACAAT ACGCTAACGA CAACGGTGTC GATGGTGTGT GGACTTATGA TGATGCGACT AAGACCTTTA CGGTCACTGA A-3〇
[0022]本发明另一方面提供一种表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒的制备方法，该 方法包括如下步骤：
[0023] a.构建细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；
[0024] b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；
[0025] c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR- 1突变株中，构建趋磁细菌MSR-1重组株，培养，制备功能化细菌磁颗粒；
[0026]优选地，所述细菌磁颗粒膜蛋白基因为mamC或mamF。
[0027]进一步的改进，本发明还提供了细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突 变株的构建方法，具体步骤如下：
[0028] (a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白基因左右两侧共两个长均为700_1000bp的同源片段； 左右两同源片段均带有两个酶切位点；
[0029] (b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒 pK18mobsacB进行双酶切；
[0030] (c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒进行连接，连接 产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；
[0031] (d)将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入 pK18m〇bsaCB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过 蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验 证，构建成细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株。
[0032] 进一步的改进，本发明还提供了功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒的构建方 法，具体步骤如下：
[0033] (1)扩增细菌磁颗粒膜蛋白基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两端分别带 有双酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶