能化细菌磁颗粒与不同浓度(5mg/ml，lmg/ml，0 · 5mg/ml，0 · lmg/ml， Ο · 05mg/ml，Ο · Olmg/ml)的人IgG溶液反应，在5分钟，10分钟，15分钟，30分钟每个时间点进 行磁分离并取上清在紫外分光光度计上测量该时间点上清溶液中的IgG含量，检测后的上 清样品继续加回试管中进行重悬孵育，在细菌磁颗粒过饱和结合IgG后结束实验，通过计算 剩余IgG的含量推算功能化细菌磁颗粒结合IgG数量，根据一个重组蛋白A分子可以结合两 分子IgG，计算功能化细菌磁颗粒上重组蛋白A的表达情况；同样的实验也选择了市售的重 组蛋白A人工合成磁珠进行比较，结果显示两者结合特异性相似，功能化细菌磁颗粒结合时 间稍快;但在结合IgG的载量方面，功能化细菌磁颗粒明显优于市售磁珠产品，同样lmg的磁 性颗粒，功能化细菌磁颗粒结合能力是磁珠颗粒的3倍左右。通过电镜观察发现功能化细菌 磁颗粒的晶型特征与普通细菌磁颗粒相同，结合IgG后功能化细菌磁颗粒大小明显增大，边 缘不再清晰可辨，显示携带有IgG分子，整个颗粒的亲水能力变强。结论是该功能化细菌磁 颗粒同等条件下比常规市售磁珠和磁性颗粒具有更强的性能。
【主权项】
1. 一种表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，其特征在于，所述功能化细菌磁颗粒 的结构物质由特定重组蛋白通过多肽链与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成;所述多肽链的 氨基酸残基为(AlamGlySer) n(GlyaSer)b(GlySerAlam)n，m = 2-5，n = 2-5，a = 2-5，b = 3-7〇2. 如权利要求1所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，其特征在于，所述细菌 磁颗粒膜蛋白基因为mamC或mamF;优选地，所述特定重组蛋白为特定重组蛋白A或特定重组 蛋白G，所述特定重组蛋白A为在重组蛋白A的B结构域的氨基酸的基础上，将第29位Gly突变 成Ala;所述特定重组蛋白G为重组蛋白G的C结构域二聚体。3. 如权利要求1所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，其特征在于，所述功能 化细菌磁颗粒是由重组趋磁细菌合成，所述重组趋磁细菌是通过如下方法构建而成的： a) 构建细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株； b) 构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒； c) 将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突 变株，构建重组趋磁细菌MSR-1。4. 如权利要求1所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，其特征在于，所述多肽 链的氨基酸残基为(厶1&]￡15^61')11(615^61')1 )(615^6"1&111)11，111=3，11 = 3，& = 2-5，匕=3-7;优 选地，111=3，11 = 3，& = 3，匕=5，多肽链的序列为5-6〇厶6(^6(^66厶厶6〇6〇厶6(：〇6(^66厶八6〇 GCAGCCGCTG GAAGCGGAGGTGGAAGCGGA GGTGGAAGCG GAGGTGGAAG CGGAGGTGGAAGCGGAGGTG GAAGCGGAAG CGCAGCCGCT GGAAGCGCAGCCGCTGGAAG CGCAGCCGCT-3〇5. 如权利要求2所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，其特征在于，所述特定 重组蛋白 A的序列是：5-GCCGACA ATAAATTCAACAAAGAACAA CAAAATGCGT TCTATGAAAT TTTACATTTACCTAATTTAA CTGAAGAACA ACGTAATGGC TTCATCCAAAGCCTTAAAGA CGATCCTTCA GTGAGCAAAG AAATTTTAGCCGAAGCGAAA AAGCTAAACG ATGCCCAAGC ACCAAAA GGTTCAGGCGGAAGC GGCGGCGGAAGC GGAGGCTCA GGTAGCGCCGACA ATAAATTCAA CAAAGAACAA CAAAATGCTTTCTATGAAAT TTTACATTTA CCTAATTTAA CTGAAGAACAACGTAATGGC TTCATCCAAA GCCTTAAAGA CGATCCTTCAGTGAGCAAAG AAATTTTAGC CGAAGCCAAA AAGCTAAATGATGCGCAAGC GCCAAAA-3。6. 如权利要求2所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，其特征在于，所述特定 重组蛋白 G 的序列是：5-ACTT ACAAACTTGTCATTAATGGT AAAACATTGA AAGGCGAAAC AACTACTAAAGCAGTCGACG CAGAAACTGC AGAAAAAGCC TTCAAACAATACGCTAACGA CAACGGTGTC GATGGTGTGT GGACTTATGATGATGCGACT AAGACCTTTA CGGTCACTGA A GGTTCAGGCGGAAGC GGCGGCGGAAGC GGAGGCTCA GGTAGCGGC ACTTACAAACTTGT CATTAATGGT AAAACATTGA AAGGCGAAACAACTACTAAA GCAGTCGACG CAGAAACTGC AGAAAAAGCCTTCAAACAAT ACGCTAACGA CAACGGTGTC GATGGTGTGTGGACTTATGA TGATGCGACT AAGACCTTTA CGGTCACTGA A-3〇7. -种表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包 括如下步骤： a. 构建细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株； b. 构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒； c .将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突 变株中，构建趋磁细菌MSR-1重组株，培养，制备功能化细菌磁颗粒； 优选地，所述细菌磁颗粒膜蛋白基因为mamC或mamF。8. 如权利要求7所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒的制备方法，其特征在 于，步骤a所述细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株的构建方法如下： (a) 扩增细菌磁颗粒膜蛋白基因左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右 两同源片段均带有两个酶切位点； (b) 左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒 pK18mobsacB进行双酶切； (c) 将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒进行连接，连接产物 转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌； (d) 将阳性克隆菌作为供体与趋磁细菌MSR-1受体菌进行亲本接合，并导入 pK18m〇bsaCB重组质粒，通过卡那抗性筛选趋磁细菌MSR-1同源整合突变株，突变株再通过 蔗糖梯度筛选趋磁细菌MSR-1双交换突变株，最后选择卡那抗性敏感的双交换菌株进行验 证，构建成细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株。9. 如权利要求8所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒的制备方法，其特征在 于，步骤b所述功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒的构建方法如下： (1) 扩增细菌磁颗粒膜蛋白基因跨膜结构域的DNA片段，所述DNA片段两端分别带有双 酶切位点；对扩增产物DNA片段及pBBR质粒进行双酶切，回收双酶切的DNA片段及双酶切的 pBBR质粒;将双酶切的DNA片段与双酶切的pBBR质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受 态细胞中，筛选连接正确的阳性克隆，得到重组质粒PBBR-细菌磁颗粒膜蛋白基因； (2) 特定重组蛋白的编码序列克隆在pUC57载体上，并分别在其5'端合成编码表达多肽 链(八1&]￡15^61')11(615^61')1 )(615^6^1&111)11，111 = 2-5，11 = 2-5,3 = 2-5，匕=3-7的基因序列，在 合成基因序列两端分别加上双酶切位点，制得多肽链-特定重组蛋白质粒； (3) 对步骤(2)基因合成得到的多肽链-特定重组蛋白质粒进行扩增和双酶切； (4) 对步骤（1)得到的重组质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白基因进行双酶切并纯化，和步 骤(3)得到的经过双酶切的多肽链-特定重组蛋白质粒的基因片段进行连接，连接产物转化 大肠感觉感受态细胞中，筛选并验证连接正确的阳性克隆，最终得到功能化细菌磁颗粒膜 蛋白融合表达质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白基因-多肽链-特定重组蛋白；所述特定重组蛋 白为特定重组蛋白A或特定重组蛋白G。10. 如权利要求9所述的表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒的构建方法，其特征在 于，步骤c所述功能化细菌磁颗粒的制备方法为： I以功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒pBBR-细菌磁颗粒膜蛋白基因-多肽链-特 定重组蛋白作为供体，通过亲本接合实验将其导入到细菌磁颗粒膜蛋白基因缺失的趋磁细 菌MSR-1突变株，构建生产功能化细菌磁颗粒的趋磁细菌MSR-1重组株； Π 趋磁细菌MSR-1重组株经过转接、发酵培养，用磁装置确定细菌表达制备功能化细菌 磁颗粒，离心收集菌体并从中提取纯化目标功能化细菌磁颗粒。
【专利摘要】本发明提供一种表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒，该细菌磁颗粒膜蛋白通过一段柔性多肽链融合表达特定重组蛋白；该特定重组蛋白为重组蛋白A改良的Z结构域二聚体或重组蛋白G的C结构域二聚体，并对它们的基因序列进行了特别修饰，使得制备的功能化细菌磁颗粒均显示优异的IgG结合能力。
【IPC分类】C12N15/03, C12N15/74, C12N1/21
【公开号】CN105624081
【申请号】CN201610052911
【发明人】张金菊, 王红光
【申请人】北京中科圆融生物科技发展有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年1月26日