[0206] 5)加20mL预冷的无菌水洗涂菌体，450化pm离屯、IOmin，收集菌体，重复2次。
[0207] 6)加2mL预冷的无菌水，2mL 50%甘油重悬菌体，轻柔混匀，200化/管，-70°C存储 备用。
[0208] 2.电击转化重组质粒到LBA4404感受态细胞
[0209] 1)取化L重组质粒分别加入到10化L感受态细胞中，轻柔混均，置于冰上约15min;
[0210] 2)将菌液转移至0.2cm预冷的电击杯中，转化条件为:2000V、25iiF、200Q ;
[0211] 3)将60化L液体LB加入电击杯中，轻柔混匀，移至的1.5mL化管中，28°C，她；
[0212] 4)将菌体涂于含相应抗体的固体LB培养基上；
[0213] 5)28°C溫箱培养40h，至有单菌落长出。
[0214] 2.8烟草的遗传转化
[0215] 1.烟草的培养
[0216] 1)将烟草种子用ImL 80%的乙醇浸泡2min。
[0217] 2)倒掉乙醇，加入ImL 5%的NaClO溶液，轻摇浸泡5min。
[0218] 3)倒掉NaClO溶液，用移液器尽量去除剩余液体，用无菌水冲洗2遍。
[0219] 4)播种于MS基础培养基上，28°C，光照培养。
[0220] 2.农杆菌的活化
[0221] 从-70 °C冰箱中取出含有pAhOdaiso日、pAh0daii68和pAhOda日18载体的农杆菌，菌株活 化过程同2.4.1。
[0222] 3.农杆菌对烟草的侵染
[0223] 1)将烟草叶片剪成直径Icm的叶盘，与农杆菌28°C，220巧m侵染20min。
[0224] 2)用无菌水冲洗3次，将叶盘置于50WHO1/L乙酷下香酬的共培养培养基上暗培养2 天；
[02巧]3)将共培养后的叶盘转到选择分化培养基(MS+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA巧OOmg/ L Cb巧Omg/L Km)上，置于28°C溫室中光照培养，每S十天更换一次培养基；
[0226] 4)待叶盘分化出的小芽长至Icm左右，切下小芽并转移到选择生根培养基中（MS+ 0.2mg/L NAA+300mg/L Cb巧Omg/L Km)继续培养，每15~20天更换一次培养基。
[0227] 2.9 GUS组织化学染色及显微观察
[022引1.将转化植物组织放入24孔板中，加入GUS染色液；
[0229] 2.37°(：培养箱中避光溫育1211;
[0230] 3.将染色组织于FAA固定液中固定化，在无水乙醇中脱色1天(去除叶绿素）；
[0231] 在SZX16型巧光体视显微镜及vhx-2000型超景深S维显微系统下观察GUS染色结 果。
[0232] 3结果与分析
[0233] 3.1根特异启动子的克隆
[0234]拟克隆contig288638上游序列，根据本实验室转录组测序结果及Blast结果，设计 引物(见表3)，W酶切花生基因组为模板的PCR扩增，得到如图1片段。与PMD-19T连接，送测 序。
[02巧]将288638的测序结果分别在NCBI中进行相似性比对，结果显示:Contig288638序 列与蔓花生2-酬戊二酸依赖性酶（4^。1113(111扣]16]1318 2-0义0旨1111日^16-(1696]1(16]11 dio巧genase A0P3-like ,Genbank No :XM_016113712.1)的相似度为99%，功能注释结果为 Arachis duranensis 2-〇xoglutarate-dependent dioxygenase A0P3-1ike (L0C107492663) ,transcript variant X2，mRNA，我们将其初步命名为AhOda基因。
[0236] 表5基因的功能注释及命名
[0237]
[0238] 3.2 AhOda根特异表达基因及启动子的生物信息学分析
[0239] 利用Plantcare在线数据库对AhOda启动子顺式作用元件进行分析（图2)，此段序 列含有15个与根特异表达相关的R00TM0TIFTAP0X1，1个与根特异表达相关元件 056130(11^0化6,2个与根特异表达相关元件05621?0(11^0化6。除此^外，还发现9个641八-motif、3个ACGT-motif、8个诱导物应答元件W-box((T)TGAC(C))，2个与干旱诱导相关MBY类 调控元件，。为了验证AhOda启动子功能及确定该启动子的最小活性区，根据AhOda启动子区 根特异相关元件的位置和数目预测，设计了=个截短的启动子片段(图3)。
[0240] 根据AhOda基因所测得的上游的contig序列，在NCBI上进行比对，预测该基因的 ATG位置，在ATG下游15化P左右处设计引物，使用SMARTer?RACE试剂盒，将纯化的花生根部 的RNA反转录为5'cDNA，根据使用说明书，应用降落PCR扩增，得到如下片段（图4)。胶回收 后，连接PMD-19T，送测序，测序序列和接头引物与启动子序列比对，确定AhOda基因转录起 始位点位于ATG上游的32bp处。
[0241] 起始密码子ATG用带*号斜体字表示；用灰色背景表示15个与根特异表达相关 R00TM0TIFTAP0X1;用蓝色背景表示1个与根特异表达相关元件0SE2R00TN0DULE;用黄色背 景表示2个与根特异表达相关元件0SE2R00TN0DULE;其他元件均用下划线表示且进行标注。
[0242] 3.3 AhOda根特异启动子植物表达载体的构建及转化农杆菌
[0243] Wp2300GUSplus为基础载体，用根特异启动子的各个截短替换p2300GUSplus上的 CaMV35S启动子，构建相应的植物表达载体，流程图见图5，构建过程如下：
[0244] WAhOda上游序列的PCR产物为模板，分别用引物对AhOdaiso日f/Ah0dar、Ah0daii68f/ Ah0dar、Ah0da5i8f/Ah0dar扩增AhOda上游180化p、1168bp和518bp的启动子片段（图6,相对应 的泳道都是泳道1)，将PCR产物连接PMD-19T，送测序，结果与已验证的序列完全一致。
[0245] 将获得的pMD-AhOdais日日、pMD-Ah0daii68、pMD-Ah0da日 18(泳道5)及基础载体 p2300GUSplus(泳道4)用BamH I和化nd皿双酶切，将目的片段与酶切后大片段连接，获得 植物表达载体pAhOdais日日、pAh0daii68和pAhOda日18,用BamH巧日Hind皿分别对3个载体（泳道 3)进行消化，分别获得1286bp、1073bp和404bp的条带，且条带大小与PCR产物一致（图6)，测 序证明植物表达载体pAhOdais日日、pAh0daii68和pAhOda日18正确。将pAhOdais日日、pAh0daii68和 pAhOdasis转化农杆菌LBA4404，PCR扩增分别获得1805bp、1168bp和518bp的启动子片段（图 7)。其序列如如沈Q ID NOl、沈Q ID N02或沈Q ID N03所示。
[0246] 3.4 AhOda根部特异表达启动子在烟草中的功能验证
[0247] 取相应转化植株进行GUS组织化学分析，发现转pAhOdais日日、pAhOda日18的植物表达 载体的烟草根部均被染成蓝色（图8、9)，而在叶片中观察不到蓝色。证明AhOda启动子为根 部特异表达启动子，最短的518bp的AhOda启动子（含有1个R00TM0TIFTAP0X1元件、1个 0SE1R00TN0DULE元件和1个0SE2R00TN0DULE元件)仍然具有指导基因在烟草根部特异表达 的功能。
【主权项】
1. 根特异性表达启动子，其核苷酸序列如SEQ ID N01、SEQ ID N02或SEQ ID N03所示。2. -种表达载体，含有权利要求1所述的特异表达启动子。3. 权利要求2所述的表述载体在转基因植物中的应用。4. 根据权利要求3所述的应用，该表达载体中插入有抗虫基因，将该表达载体转入植物 中，使其根中表达该抗虫基因，以防治地下害虫。5. 权利要求1所述的根特异性表达启动子在转基因植物中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，为将含有权利要求1所述的根特异性表达启动子和抗虫 基因的表达载体转入植物中，使其在种子或根尖表达该抗虫基因，以防治地下害虫。
【专利摘要】本发明涉及根特异性表达AhOda启动子及其应用，属于生物技术领域。根特异性表达启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所示。本发明克隆花生根特异启动子，并通过截短实验确定启动子核心区域，验证各启动子的功能，为我国花生生物技术应用与发展奠定基础；为获得双价抗蛴螬花生品种提供高效、稳定、特异表达的启动子提供重要分子基础。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/82, C12N15/113
【公开号】CN105695471
【申请号】CN201610265028
【发明人】耿丽丽, 张 杰, 冯艳芳, 束长龙, 彭琦, 宋福平, 梁影屏
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年4月26日