变体的ALS酶活性无显 著性差异（图4、图5);而加入ALS抑制剂百垄通后，野生型的A530吸光值仅为0.3,9311M1和 9311M2的A530吸光值为1.1左右，即野生型的ALS酶活性仅为对照的25%左右，而9311M1和 9311M2的ALS酶活性仍有80%左右（图4、图5)，突变体的ALS酶活性是野生型的3倍多，表明 931 IMl和9311M2的突变ALS对百垄通不敏感，从而赋予了抗性。
[0化9] 同样的，A530吸光值测定结果发现，当野生型、9311M1和9311M2的ALS提取液中没 有ALS抑制剂甲喀横隆时，它们的A530吸光值均在1.3-1.5间，表明野生型和突变体的ALS酶 活性无显著性差异（图6、图7);而加入ALS抑制剂甲喀横隆后，野生型的A530吸光值仅为 0.2,931謹1和931謹2的4530吸光值为0.7-0.8左右，即野生型的415酶活性仅为对照的16% 左右，而931 IMl和9311M2的ALS酶活性仍有54 %左右（图6、图7 )，突变体的ALS酶活性是野生 型的3倍多，表明931 IMl和9311M2的突变ALS对甲喀横隆不敏感，从而赋予了抗性。
[0060] 实施例7转基因 ALS水稻抗百垄通、甲喀横隆
[0061] 设计特异引物5'-〔6〔6641'(：〔41'(：〔646(：〔4〔4〔41^6(：(：1'(：-3'和5'-TCCCCGCGGCCTACGGAAAACAACACAC-3'，其5'分别加入BamH巧日SacI酶切修饰位点。参考实施 例3的方法，通过PCR从上述水稻突变体931 IMl和9311M2的基因组DNA中扩增出突变ALS基 因，测序正确后，用BamHI和Sac I分别双酶切突变ALS基因片段和植物表达载体 pCAMBIAl301质粒(购自pcambia公司），酶切产物用T4-DNA酶(购自hKaRa公司）连接，连接 产物转化大肠杆菌。重组质粒提取DNA，用BamHI和SacI双酶切验证，可W产生大的质粒片段 和小的基因片段（图8)，证明已将核巧酸序列如SEQ ID NO. 1或3所示的ALS基因克隆至植物 表达载体PCAMBIA1301质粒（购自pcambia公司）中。将构建好的质粒载体转化农杆菌 EHA105,培养菌体。采用常规的农杆菌介导法转化梗型水稻日本晴(购自江苏省农业种质资 源保护与利用平台），获得转基因植株收种后，后代植株长至3-4叶期时，PCR检测转基因植 株（图9)。PCR检测引物为正向引物3 5 SF 5 ' -ATGGTTAGAGAGGCTTACGC-3 '，反向引物5R5'-AGCAACAGGTCAGCCTTATCCAC-3 '，扩增片段涵括CaMV35S启动子和ALS基因的5 '端序列，大小 约2kb"PCR扩增反应体系参考实施例3，PCR扩增反应程序采用两步法，退火和延伸合为一 起，采用68度。扩增程序如下:预变性:98 °C 3min; 30个循环:变性98 °C IOsec;延伸68 °C 2min; 保溫：72°C10min。经PCR鉴定呈阳性后，喷施4mL百垄通/L水（12倍推荐使用浓度）或喷施 4.5g/L甲喀横隆(8倍推荐使用浓度），7天后，参照实施例6所述方法测定ALS酶活性，发现转 基因水稻的ALS酶活性显著高于非转基因水稻;30天后发现转基因水稻生长状态良好，而非 转基因日本晴水稻则全部枯死。
[0062] 实施例8转基因ALS烟草抗百垄通、甲喀横隆
[0063]设计特异引 物5'-CGCGGATCCATCCGAGCCACACATCGCCTC-3'和5'- TCCCCGCGGCCTACGGAAAACAACACAC-3'，其5'分别加入BamHI和SacI酶切修饰位点。通过PCR从 上述水稻突变体9311M1和9311M2的基因组DNA中扩增出突变ALS基因，测序正确后，参照实 施例7方法将核巧酸序列如SEQ ID NO. 1或3所示的ALS基因克隆至植物表达载体 PCAMBIA2301质粒(购自pcambia公司）中。挑选阳性克隆转化农杆菌EHA105,采用常规的农 杆菌介导法转化本氏烟叶盘，获得转基因植株收种后，后代植株长至3-4叶期时，经PCR鉴定 呈阳性后，喷施4mL百垄通/L水（12倍推荐使用浓度)或喷施4.5g/L甲喀横隆（8倍推荐使用 浓度），7天后，参照实施例6所述方法测定ALS酶活性，发现转基因烟草的ALS酶活性显著高 于非转基因烟草;30天后发现转基因烟草生长状态良好，而非转基因烟草则全部枯死。 [0064]实施例9转基因拟南芥获得
[0065]设计特异弓|物5'-〔6〔6641'(：〔41'(：〔646(：〔4〔4〔41^6(：(：1'(：-3'和5'-TCCCCGCGGCCTACGGAAAACAACACAC-3'，其5'分别加入BamHI和SacI酶切修饰位点。通过PCR从 上述水稻突变体9311M1和9311M2的基因组DNA中扩增出突变ALS基因，测序正确后，参照实 施例7的方法将核巧酸序列如SEQ ID NO. 1或3所示的ALS基因克隆至植物表达载体 PCAMBIA2301质粒(购自pcambia公司）中，挑选阳性克隆转化农杆菌EHA105,培养菌体，通过 农杆菌介导方法转化拟南芥（Clough S,Bent A.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant Journal, 1998,16(6) :735-743.),转化的拟南芥成熟收种后，随即播种，对未抽臺的拟南芥幼苗喷施 3mL百垄通/L水(9倍推荐使用浓度），30天后发现非转基因拟南芥枯死，而转基因拟南芥生 长状态良好。
[0066] 实施例10转基因棉花获得
[0067] 设计特异弓|物5'-〔6〔6641'(：〔41'(：〔646(：〔4〔4〔41^6(：(：1'(：-3'和5'-TCCCCGCGGCCTACGGAAAACAACACAC-3'，其5'分别加入BamHI和SacI酶切修饰位点。通过PCR从 上述水稻突变体9311M1和9311M2的基因组DNA中扩增出突变ALS基因，测序正确后，参照实 施例7的方法将核巧酸序列如SEQ ID NO. 1或3所示的ALS基因克隆至植物表达载体 PCAMBIA2301质粒(购自pcambia公司）中，挑选阳性克隆转化农杆菌LAB4404,培养菌体，通 过农杆菌介导方法转化棉花下胚轴和子叶，获得转基因植株收种后，后代植株长至2-3叶期 时，经PCR鉴定呈阳性后，对幼苗喷施3mL百垄通/L水(9倍推荐使用浓度），30天后发现非转 基因棉花枯死，而转基因棉花生长状态良好。
[0068] 尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细描述，本领域技术人员将会理解。根据 已经公开的所有教导，可W对那些细节进行各种修改和替换，运些均在本发明的保护范围 内。本发明的全部范围由所附专利要求极其任何等同物给出。
【主权项】
1. 一种ALS突变型基因，其在水稻的ALS基因序列的第75位核苷酸由G变成核苷酸C、第 339位核苷酸由A变成核苷酸C和第710位核苷酸由C突变为核苷酸T。2. 根据权利要求1所述的ALS突变型基因，其特征在于，所述ALS突变型基因其核苷酸序 列如SEQ ID No:3所示。3. 权利要求1或2所述的ALS突变型基因所编码的ALS蛋白。4. 根据权利要求3所述的ALS蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。5. 表达盒、重组载体或细胞，其含有权利要求1或2所述的ALS突变型基因。6. 权利要求1~2所述的ALS突变型基因、权利要求3或4所述的蛋白，权利要求5所述的表 达盒、重组载体或细胞在绿色植物抗除草剂方面的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述绿色植物为水稻、烟草、拟南芥或棉 花。8. 获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 使绿色植物包含权利要求1或2所述的ALS突变型基因；或 2) 使绿色植物表达权利要求3或4之任一所述的ALS蛋白。9. 根据权利要求8的方法，其特征在于，其包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。10. 鉴定权利要求8或9所述的方法获得的绿色植物的方法，其特征在于，包括以下步 骤： 1) 测定所述绿色植物是否包含权利要求1或2所述的ALS突变型基因；或， 2) 测定所述绿色植物是否表达权利要求3或4之任一所述的ALS蛋白。11. 一种除草剂的防护剂，其特征在于，该防护剂由权利要求3或4之任一所述的ALS蛋 白制成。
【专利摘要】本发明公开了一种ALS突变型基因，其在水稻的ALS基因序列的第75位核苷酸由G变成核苷酸C、第339位核苷酸由A变成核苷酸C和第710位核苷酸由C突变为核苷酸T。本发明还公开了一种ALS突变型基因所编码的ALS蛋白在抗除草剂方面的应用。该蛋白来源于抗ALS抑制剂类除草剂的水稻突变体植株，与水稻野生型ALS序列相比，其蛋白序列在Gln25、Gln113和Ala237位点发生突变。绿色植物表达该蛋白序列可以抗（耐）乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂，特别是咪唑啉酮和磺酰脲类除草剂。CGMCC No. 1226520160330
【IPC分类】C12Q1/68, A01H5/00, A01P13/00, A01N47/44, C12N9/88, C12N15/60
【公开号】CN105695493
【申请号】CN201610225366
【发明人】张保龙, 陈天子, 凌溪铁, 王金彦
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年4月12日