一种新的杜松烷型倍半萜类化合物及其制备方法和医药用图
【专利摘要】本发明公开了一种新的杜松烷型倍半萜类化合物及其制备方法和医药用途。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的杜松烷型倍半萜类化合物，可以从九里香的干燥叶中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物能够使H2O2应激损伤后心肌细胞存活率明显增加，培养液中LDH活性明显降低，可以用来开发成心肌保护的药物。
【专利说明】
-种新的杜松烧型倍半瞄类化合物及其制备方法和医药用途
技术领域
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体设及从九里香的干燥叶中分离得到的一种具有屯、 肌保护作用的杜松烧型倍半祗类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 九里香Murraya exotica L.为芸香科九里香属植物，主要分布在我国云南、贵州、 湖南、广东、广西、福建、海南、台湾等省区，W及亚洲一些热带及亚热带地区，其气香，味苦、 辛，有麻舌感，具有行气止痛、活血散疲之功效，用于胃痛、风湿搏痛，也用于治疗牙痛、跌扑 肿痛、虫蛇咬伤。很早W前，我国南方就将九里香作为一种民间用药，用于治疗各种病症，特 别是炎性病变和镇痛。
[0003] 近年来，中外学者对九里香的化学成分进行了大量研究，从其叶、根皮、果实等部 位中分离得到了多种化合物，主要包括香豆素类、黄酬类、生物碱类W及挥发油等。九里香 含有大量的香豆素类成分，运类成分的常见特征为在7-甲氧基或5,7-二甲氧基香豆素骨架 的C8位带有异戊二締单位，W氧化、醋化或骨架重排等多种形式存在。九里香含有多种黄酬 类化合物，还含有黄酬巧类成分。九里香的叶中含有大量的黄酬类和香豆素类化合物，而九 里香的根、皮中主要含有生物碱类成分。挥发油类是九里香的主要化学成分之一。其挥发油 成分的含量因品种、采收季节、地区不同而存在差异，含量的高低影响九里香的药材质量及 临床疗效。
[0004] 现代药理研究表明九里香具有杀虫、消炎镇痛、抗菌及抗氧化等作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从九里香的干燥叶中分离得到的一种具有屯、肌保护作 用的杜松烧型倍半祗类化合物及其制备方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得W实现的：
[0007] 具有下述结构式的化合物（I)，
[0008；
[0009]所述的化合物（I)的制备方法，包含W下操作步骤：（a)九里香的干燥叶粉碎，用75 ~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和水饱和的 正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步骤(a)中乙酸 乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗脱12个柱体 积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（C)步骤(b)中75%乙醇洗脱物 浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烧-甲醇梯度 洗脱得到5个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1 和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的 反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱 液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0010] 进一步地，步骤(a)中，用80%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0011] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0012] -种药物组合物，该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I)和 药学上可接受的载体。
[0013] 所述的化合物(I)在制备屯、肌保护的药物中的应用。
[0014] 所述的药物组合物在制备屯、肌保护的药物中的应用。
[0015] 本发明化合物用作药物时，可W直接使用，或者W药物组合物的形式使用。
[0016] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0017] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 W及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物W单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0018] 图1为化合物（I)结构式；
[0019 ]图2为化合物（I)理论ECD值与实验ECD值比较。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可W对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0021] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0022] 试剂来源：乙醇、石油酸、乙酸乙醋、正下醇、二氯甲烧为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0023] 制备方法：（a)将九里香的干燥叶(8kg)粉碎，用80%乙醇热回流提取(2化X3次）， 合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油酸(化X3次）、乙酸乙醋(化X3次)和水饱和的 正下醇（化X3次)萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物（363g)和正下醇萃取物； (b)步骤(a)中乙酸乙醋萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用 75%乙醇洗脱12个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏（145g); (C)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(8个柱体积）、50:1 (8个柱体积）、30:1(6个柱体积）、15:1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积）的二氯甲烧-甲醇梯 度洗脱得到5个组分；（d)步骤(C)中组分4(47g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为 20:1(8个柱体积）、15:1(10个柱体积)和5:1(6个柱体积）的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3 个组分；（e)步骤(d)中组分2(26g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度 为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合 物（I)(39mg)。
[0024] 结构确证：无色立方晶（甲醇），烙点189-19rC ;HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z 257.1510,结合核磁特征可得分子式为Cl出22〇2,不饱和度为5。核磁共振氨谱数据SH(ppm， DMS0-d6,400MHz)，H-l(2.24，m)，H-2(2.81，m)，H-2(3.07，m)，H-5(5.61，br，d，J=4.2)，H-6 (2.02，m)，H-7(1.71，m)，H-8(1.91，m)，H-8(2.18，m)，H-9(5.36，br，s)，H-ll(1.93，m)，H-12 (3.32，m)，H-12(3.59，m)，H-13(0.84，d，J = 7.0)，H-14(2.35，s)，H-15(1.64，s);核磁共振 碳谱数据Sc(ppm，DMS0-d6, lOOMHz) :39.6(CH，1-C)，39.7(C此，2-C)，199.1 (C，3-C) ,135.9 (C，4-C)，128.3(CH，5-C)，37.2(CH，6-C)，35.1(CH，7-C)，25.0(CH2,8-C)，121.8(CH，9-C)， 136.5(C，10-C)，35.6(CH，11-C)，66.4(CH2，12-C)，10.5(CH3，13-C)，17.3(CH3，14-C)，21.5 (畑3，15-C);碳原子标记参见图1。红外光谱表明该化合物含有径基和幾基（3300cm-i和 1746畑1-1)。1护醒財普显示了^个甲基信号[姐0.84((1，1 = 7.0化，]\16-13)，1.64(3，]\16-15)和 2.35(3，16-14)]，一个含氧亚甲基信号[姐3.32(111，护12)和3.59(111，护12)]，两个締属次甲 基信号[化5.36(br，s，H-9)和5.61化'，(1，1 = 4.2化，护5)]。13(：-醒財普显示出15个共振碳信 号，包括S个甲基，S个亚甲基（一个含氧亚甲基SC66.4)，六个次甲基（两个締属次甲基5 (：121.8和128.3)，^及^个季碳(一个幾基碳此199.1，两个締控季碳此135.9和136.5)。1护 NMR谱中，低场信号姐1.64和2.35(各3H，s)表明它们为与双键相连的甲基。Ih-Ih COSY谱中 H-Il与此-12和Me-13的相关性表明C-Il位上连有一个甲基。丽BC谱中含氧亚甲基信号[S 册.32(m，H-12)和3.59(m，H-12)]与C-11(SC35.6)和C-13(SC10.5)的相关性，W及含氧亚甲 基信号（SC66.4)表明C-12为径基亚甲基，与C-11相连。综合氨谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱， W及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过 ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
[0025] 实施例2:化合物（I)药理作用试验 [002引一、材料和仪器
[0027]新生1~3天SD大鼠乳鼠（SPF级），雌雄不拘，由广西医科大学实验动物中屯、提供 (试验动物生产许可证:SCXK桂2009-0002)。化合物（I)(纯度>98% )为自制。胎牛血清购于 Hy Clone公司，DMEM培养基购于GIBCO公司，二甲基亚讽(DMSO)、0.25 %膜酶(含抓TA)购于 Solarbio公司，5-漠脱氧尿巧（5-Brdu)、四甲基偶氮挫盐(MTT)购于美国Sigma公司，LDH测 试盒购于南京建成生物工程研究所，NOS试剂盒(分型）南京建成生物工程研究所，ATP酶试 剂盒(南京建成生物工程研究所），cTnI酶联免疫吸附测试试剂盒、CK-MB酶联免疫吸附测试 试剂盒购于武汉优尔生。
[002引 C02培养箱（Thermo化rma)，CKX41相差显微镜（OLUMPUS) ,Model 450自动酶标仪 (美国Bio-Rad公司），96孔板(JET)，722sp可见分光光度计(上海棱光技术有限公司），可调 式微量移液器(Thermo化rma)，单人单面超净工作台（苏州净化设备总厂），XD-IOl型倒置 生物显微镜（南京江南光电），DW-40L262(低溫保存箱）、DW-8化628立式超低溫保存箱 化aier特种电器有限公司），手提式压力蒸汽灭菌器、立式蒸汽灭菌器(广州华南医药器械 有限公司），JA2003微量天平（上海第二天平仪器厂），5415D型低溫高速离屯、机（德国 化pendorf) ,LQP-B-4颗粒制冰机(上海安亭）。
[0029] 二、试验方法
[0030] 1、屯、肌细胞的原代培养
[0031] 具体步骤：（1)超净工作台中，将乳鼠放置于250mL烧杯中，喷W75%酒精进行皮肤 消毒。（2)左手捏住鼠背部，右手持无菌眼科剪在胸骨正中偏左平剑突刺入胸腔，抬起剪刀 头端，向前挑起剪一纵向切口，再平剑突往左右剪开约2cm，左手捏住背部皮肤挤压胸部，就 可W见跳动的屯、脏，换无菌弯綴将屯、脏取出，置于冷的PBS溶液培养皿中。用无菌眼科剪和 綴除去屯、房、结缔组织及细胞膜后将屯、脏放入IOmL西林瓶中，用冷PBS溶液反复冲洗S遍， 洗净残血。（3)用无菌弯剪剪碎屯、脏(约1~2mm大小），加入冷PBS溶液，并冲洗无菌弯綴，用 吸管将小组织块悬液转移至离屯、管中，冷PBS再清洗两遍。（4)第一、二次消化:按预溫好的 膜酶与组织块W2:l的比例缓慢沿离屯、管壁缓慢加入，室溫下W无菌吸管反复轻柔吹打帮 助消化，观察组织块出现丝状物，上清变浑浊，根据浊度停止消化，吸出第一、二次消化的上 清液，弃去。（5)继续消化，步骤同(4)，直至小组织炔基本消化完全为止。收集细胞悬液。（6) 将所有细胞悬液过200目细胞筛，加入含10 %胎牛血清的DMEM培养液终止消化，冷PBS洗涂， 1 OOOrpm离屯、2次，每次Smin，弃去上清。（7)台吩兰计数：（6)所得沉淀中加入适量DMEM培养 基，制成细胞悬液，取0.4%台吩兰染液10化与细胞悬液90化混匀，室溫放置2~3min，将清 洁的细胞计数板放置在倒置显微镜台上，在盖玻片边缘滴1~2滴已染色好的细胞悬液，镜 检可见圆形分散的细胞分布在各处，活细胞整体完整，透明而不着色，而不健康细胞会着 色，计数时除去，计数四大方格的细胞数。压线的细胞只记左线和上线者，细胞团按一个细 胞计数，按W下公式计算悬液的细胞数。细胞数/mL=四大方格细胞数总数/4 X 10000 X稀 释倍数(8)按3 X IO5~5 X 105细胞密度接种到培养瓶中，放入95 %〇2，5 % C〇2培养箱中差速 贴壁约化。差速贴壁后的细胞悬液接种至培养板中，前4加加入终浓度为lOOwnol/L的5- Brdu, W抑制非屯、肌细胞的生长，置于培养箱中继续培养。每2地进行换液。
[0032] 2、过氧化氨诱导屯、肌细胞氧化应激损伤模型的建立
[0033] 选取培养3~4天、生长良好、搏动规律的屯、肌细胞，吸弃孔内旧培养基，换新培养 基，同时加入终浓度为eOOwiiol/L的出化，重置于C〇2培养箱中，常规培养2地，建立出化诱发屯、 肌细胞氧化应激损伤模型。
[0034] 3、实验分组及给药
[0035] 化合物（I)给药设低、中、高S个剂量组，浓度分别为0.6、6和60皿〇1凡；阳性药物 维拉帕米(Verapamil)组的终浓度为25皿ol/L。选择生长良好、搏动规律的细胞，随机分为： 正常（con化01);模型(Mode 1);阳性药物组;溶媒对照组(DMSO);化合物（I)低、中、高剂量， 共7组，每组设6个复孔。各组均于造模前1化吸去孔内旧培养液，换成化nks液W使各组细胞 同步生长（即平衡），各给药组在造模前加入相应药物预解化。除正常组外，平衡后的各组细 胞均按上方法加入建立屯、肌细胞此化损伤模型。造模结束后吸取各组细胞培养上清液，-20 °(：冰箱保存待测生化指标。各组屯、肌细胞则按常规方法加入适量0.125%膜蛋白酶消化，4 °C、800rpm离屯、lOmin，弃去上清，W生理盐水制成2X106~3X106细胞悬液，-8(rC冰箱保存 备用。
[0036] 4、MTT法测定屯、肌细胞存活力
[0037] 用96孔板培养的各组屯、肌细胞于造模后加入10化MTT继续培养地，倾去培养液， 加入DMSO 15化L，平板震荡器震荡5min，使结晶物充分溶解。W化nks液培养调零，用酶标仪 W570/630nm双波长测定去除本底光吸收值后的吸光度(OD值），重复3次。
[003引5、屯、肌细胞培养液中LDH活力的测定
[0039] 实验原理:乳酸脱氨酶(LDH)能催化乳酸生成丙酬酸，丙酬酸与2,4-二硝基苯阱反 应生成丙酬酸二硝基苯腺，在碱性溶液中呈栋红色，通过比色可求出酶活力。样品前处理， 按照下表进行。依照试剂盒要求将辅酶I、碱性溶液适当稀释。
[0040]
[0041 ] 计算屯、肌细胞培养液中LD田舌力：LD田舌力(U/L) = (ODu-ODcV(ODs-ODb) X Cs XNX 1000 dN为培养液的稀释倍数。
[0042] 6、统计分析
[0043] 数据采用平均值±标准差（玉±8)表示，应用SPSS 13.0统计软件分析处理数据，计 量资料组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。
[0044] S、结果及结论
[0045] 1、过氧化氨损伤前后屯、肌细胞活力
[0046] 正常组的细胞存活率按100%计，试验结果显示:也〇2应激损伤后屯、肌细胞存活率 较正常组屯、肌细胞下降（P<〇.05) ;DMS0溶媒组与模型组相比较，DMSO对屯、肌细胞存活率无 影响(P〉0.05);而化合物（I)各给药组均能使屯、肌细胞存活率明显增加(P<0.01)。结果见表 1 (冲<0.0 lvs正常组，胖<0.0 lvs模型组，▲?〉0.05vs模型组）。
[0047] 2、屯、肌细胞过氧化氨损伤培养液中LDH的活性
[004引与正常组比，模型组LDH含量明显增高(P<0.01);与模型组比较，溶媒组的L畑含量 无显著性差异(P〉0.05)，而化合物（I)低、中、高剂量组、阳性药物组的LDH活性明显降低(P< 0.0 l)。见表2(冲<0.0 lvs正常组，胖<0.0 lvs模型组，▲?〉0.05vs模型组）。
[0049] 提示化合物(I)可W进一步研究开发成屯、肌细胞保护的药物。
[0050] 表1化合物（I)对也〇2应激损伤后屯、肌细胞存活率的影响(x± S，n = 6) 「0化11
[0054] 实施例3
[0055]片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或巧樣 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0056] 实施例4
[0057] 口服液制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或巧樣 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服 液。
[0化引实施例5
[0059] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒 石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0060] 实施例6
[0061] 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或巧 樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0062] 实施例7
[0063] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，揽拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安飯中，低溫冷冻干燥后无菌烙封 得粉针剂。
[0064]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可W对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物α)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：（a)将九里 香的干燥叶粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙 酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇 洗脱12个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中75% 乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80 :1、50 :1、30 :1、15:1和1:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分;（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比 为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷 基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱 体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)中，用80%乙醇热 回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于:该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化 合物(I)和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备心肌保护的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备心肌保护的药物中的应用。
【文档编号】A61P9/00GK105924341SQ201610521261
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】郑飞珍
【申请人】郑飞珍