专利名称：均一尺寸纳米颗粒荧光微球的制备方法
技术领域：
本发明涉及利用控制微乳液的形成来实现对纳米颗粒聚集体尺寸的控制，达 到均一尺寸荧光微球的制备，属于纳米级纳米颗粒团聚体的制备的技术领域。
背景技术：
纳米颗粒的独特荧光性质可以用作生物标记物，现有的方法是通过化学修 饰，使纳米颗粒表面包复具有生物特异基团的偶联分子，达到对不同生物物质的 标记，但是由于单个半导体量子点的荧光强度较弱，难以实现单个颗粒的识别， 而且单个颗粒的表面修饰不能有效地消除小颗粒(<10纳米)表面物理吸附带来
的非特异结合。将多个纳米颗粒包裹形成密集的球形团聚体。这种团聚可以是单 一纳米颗粒，也可以是不同发光波长，或者是顺磁纳米颗粒的多元组合，通过适 当的表面修饰，可以达到同时满足高灵敏度、生物特异性、高生化活性的要求， 达到对生物分子的多重编码、多功能标记甚至高效分离的要求。
为了提高荧光标记物识别的准确性，需要微球具有足够的尺寸均匀性，目前
达到10%以下直径偏差的微球制备技术多采用化学方法，即在溶液中产生均匀大
小的微乳液液滴，液滴中包含无机固体颗粒或药物分子，以及聚合物分子，这些 聚合物分子在液滴中聚合，形成大小相同的聚合物复合微球。这些液滴的形成可 以通过在水相中加入表面活性剂分子，然后用微流体或微孔板方法，在油相中形 成大量孤立的相同尺寸液滴。相对其他方法，这种方法得到的微球具有很高的尺 寸均匀性和球形度。微球之间互不接触，容易进行后续的表面修饰。但这类微球 的直径大多在一微米以上，在溶液中完全沉降到容器底部，大大降低生物标记的
敏感性和生物活性;其他微乳液方法能得到包含有荧光或磁性纳米颗粒的绝缘体 或聚合物微球，尺寸可以达到几十纳米，单其中包含的纳米颗粒很少， 一般比微 球体积小千倍，其微弱的光学和磁学信号不能达到单分子检测的要求。因此制备
更小尺寸且具有高荧光亮度的微球，为高通量、高灵敏度、低含量生物检测提供 更有力的工具。
目前水溶性量子点的制备和表面修饰技术较为成熟，利用微乳液在油相中溶 解形成纳米颗粒聚集体("em ifeter. 2003， 75, 528)或蛋白质分子聚集体 (尸/ arTZ7acei/"'ca7 v esearc力，i7, 7^5)有过报道，但这些报道的微球 尺寸均大于l微米，且尺寸不均匀，不能实现在纳米尺寸范围内对微球尺寸的控 制，且颗粒间靠物理吸附团聚，难以在长期储存、超声震动、加热等条件下稳定。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种均一尺寸纳米颗粒荧光微球的制备方 法，该制备方法容易实现大量制备几十到几百纳米范围内尺寸可控微球，微球内 纳米颗粒紧密堆积，颗粒之间相互偶联，单个微球具有高强度荧光信号，为生物 单分子检测、基因芯片、蛋白质芯片、免疫芯片提供理想标记物。 技术方案本发明的均一尺寸纳米颗粒荧光微球的制备方法为 将构成微球的荧光纳米颗粒胶体水溶液的浓度调整到微摩尔量级，得到在水
溶液中分散均匀的胶体溶液；以0. 5~1. 25%Vs/rain的速度将上述水溶液中分散均 匀的胶体溶液通过毛细管注入油相溶剂中形成液滴，V,为油相溶剂的体积；毛细 管内径在0. 5到1. 5mm之间，每注入10秒，间歇5分钟，回流溶剂的流速为 0.6~1.3%Vs/sec，流速误差小于5%;油相溶剂采用二元或多元混合物，其对水 的溶解度在2%到10%之间，混合物密度等于水的密度；容器和回流管采用疏水材 料；液滴中的水被油相吸收，纳米颗粒聚集成密集球形；用吸水剂连续吸收油相 中溶解的水，使油相中水含量远低于饱和；被通过调节量子点胶体溶液的浓度和 回流泵流速，得到尺寸在几十到几百纳米，球形度高于5%，尺寸偏差小于10% 的纳米颗粒聚集体；
使用的构成微球荧光纳米颗粒表面修饰有端基为氨基或羧基的分子，具体方 法为用氨基硫醇通过共价结合吸附在纳米颗粒表面;或使用巯基有机酸置换高温 油相法得到的核/壳结构量子点表面修饰的TOPO分子；
所述微球的结构为纳米颗粒被分子偶联形成的密集聚集体，偶联方法为在微 球形成后的油相中加入偶联分子，充分反应后，再在油相中加入钝化分子，反应 结束，对油相重复进行离心分离，洗涤，得到稳定的悬浮于水中的单分散量子点 荧光微球。
所述构成微球的荧光纳米颗粒为水溶性量子点结构，是CdS、 CdSe、 ZnS、 CdTe材料的纳米颗粒或核/壳结构复合纳米颗粒，或是这些纳米颗粒的多元组200810021960.0
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合，或是这些材料同磁性纳米颗粒的多元组合，纳米颗粒在超纯水中形成单分散 胶体。
通过毛细管注入油相的胶体溶液液滴的尺寸通过调整单根或多根毛细管阵 列的直径以及在共轴毛细管外平行流动的连续油相的速度来调整，载入水相的油 相通过回流泵循环，油相中溶解的水通过用透析膜分隔的高效吸水剂来脱水，吸 水剂不溶于水和油相溶剂，吸水速度大于lmg/min。
所述微球的尺寸通过调节溶解在水相中的纳米颗粒浓度和注入油相的水相 液滴直径来调节，纳米颗粒是密集排列，微球的直径等于
<formula>complex formula see original document page 6</formula>其中Ds为微球的直径，单位为微米；p为量子点材料
的密度，单位为克/厘米3; Ms为量子点胶体溶液中量子点材料的质量摩尔浓度；
Dd为注入油相液滴的直径，单位为微米。
微球中包含的的纳米颗粒表面用端基为氨基或羟基的分子修饰，并用偶联分 子对纳米颗粒进行交联，当纳米颗粒表面修饰分子端基为氨基时，偶联分子为二
元醛，二元醛是丙二醛到辛二醛的任一种；当纳米颗粒表面修饰分子端基为羧基 时，偶联分子为二胺，二胺是乙二胺到丁二胺的任一种，偶联分子在油相中含量 为P/。体积比；其后在油相中加入约3%体积比钝化分子对微球表面钝化，偶联分 子为二醛时钝化分子为正丙胺，偶联分子为二胺时钝化分子为正丙醛。
有益效果本发明提供了新的制备量子点密集排列荧光微球的方法，该方 法弥补了其他在几十到几百纳米范围内可控制备微球方法的缺陷，得到的微球具 有高均匀性、尺寸可以任意调节，方法简单、廉价、可以大规模制备，微球在微 乳液中形成，量子点间距通过调节修饰于量子点表面的分子长度和偶联分子的长 度，可以在几纳米范围内调节。用这种方法得到的多量子点微球在生物环境中保 持稳定，微球之间不团聚。量子点密集排列，发光强度高。本发明最大限度发挥 量子点的荧光特性，为有效克服单个量子点在生物标记时的吸附提供基本条件。
该微球适用于蛋白质、DNA的荧光标记，提供满足被标记物所需最佳尺寸的 高荧光效率标记微球。该方法在所有尺寸调节范围内均能达到尺寸偏差小于 10%、球形度偏差小于5%。该微球包含密集排列的荧光纳米颗粒，在pH值接近
中性的生物缓冲溶液中保持稳定。微球中纳米颗粒间距可调，间距相等。 本发明在几十到几百纳米范围内实现纳米颗粒聚集微球的尺寸控制，方法简
单，容易实现大量制备。通过改善水溶性纳米颗粒在水相中的聚集程度，利用该 方法可以制备尺寸更均匀的微球。纳米颗粒的间距通过表面修饰的分子大小来调 节，调节精度可以达到埃范围内精确，达到不损失荧光效率的最小微球体积。同 时基本相同的颗粒间距使得颗粒间耦合基本相同，并且可以调节，使得微球荧光 特性达到均一。以前的单分散微球制备技术均采用聚合物包埋方法获得纳米颗粒 微球，微球内颗粒间距不可控制，颗粒间非均匀能量转移使荧光峰展宽。本发明 颗粒间耦合基本一致，克服以前微球制备颗粒非均匀聚集使荧光特性下降的弱 点。
由于微球中包含更多的纳米颗粒，因此具有更高的发光亮度，而更小的体积 使得微球在溶液中可以形成单分散胶体，便于生物标记。而一定的尺寸，使得微 球不容易由于表面吸附而同生物分子或细胞表面形成物理吸附，降低标记的特异 性。
本发明提供高效、几十到几百纳米范围内尺寸可控微球的制备技术，尺寸均 一，荧光特性均一，可以克服其他生物标记物由于非特异性吸附、荧光信号弱、 荧光不均匀、易淬灭等不足，为生物单分子检测、基因芯片、蛋白质芯片、免疫 芯片提供理想标记物。
图1为微球制备过程示意图； 图2为微球的透射电镜照片； 图3为微球的扫描电镜照片。
具体实施例方式
本发明的均一尺寸纳米颗粒荧光微球的制备方法为
1、 采用水溶性量子点结构纳米颗粒作为构成微球的基本单元，纳米颗粒在 水相中形成单分散胶体溶液，胶体溶液经过纯化处理；
2、 将构成微球的荧光纳米颗粒胶体水溶液的浓度调整到微摩尔量级，以恒 定的速度将上述胶体溶液通过毛细管注入油相溶剂，毛细管与油相溶剂喷头共 轴，油相溶剂流动方向与毛细管平行，注入的水相在油相中形成相同尺寸液滴， 油相溶剂对水溶解度有少量溶解度，液滴中的水分子溶入油相，纳米颗粒聚集形
成球形聚集体；
3、 构成微球的荧光纳米颗粒可以是CdS、 CdSe、 ZnS、 CdTe材料的纳米颗粒 或核/壳结构复合纳米颗粒,或是这些纳米颗粒的多元组合，或是这些材料同磁性 纳米颗粒的多元组合。
4、 所述纳米颗粒表面用端基为氨基或羧基的表面活性分子来实现表面修饰， 表面基团为氨基或羧基的纳米颗粒按已有文献报道的方法制备，表面活性分子以 共价方式同纳米颗粒结合，氨基或羧基端基具有反应性；
5、 微球中的纳米颗粒用偶联分子交联，具体方法为当一定量胶体水溶液 被注入油相形成大量球形聚集体后，在油相中加入偶联分子(纳米颗粒端基为氨 基时，偶联分子为二元醛，纳米颗粒端基为羧基时，偶联分子为二胺)，然后加 入钝化分子(偶联分子为二元醛时为正丙胺，偶联分子为二胺时为正丙醛)，形 成稳定的球状纳米颗粒密集聚集体。
6、 所述方法得到尺寸均一的纳米颗粒微球，微球尺寸可以通过控制水相液 滴大小和纳米颗粒胶体溶液的浓度来调整，调整范围在几十纳米到几百纳米之 间。
本发明荧光纳米颗粒采用水溶性量子点发光材料，可以是CdS、 CdSe、 ZnS、 CdTe等材料的纳米颗粒或核/壳结构复合纳米颗粒，也可以是这些纳米颗粒的多 种组合，或上述纳米颗粒同Fe:A,Co等顺磁性纳米颗粒的多种组合，要求纳米颗 粒尺寸均匀，尺寸小于10纳米，表面修饰有适当配体基团，能在水中形成单分 散胶体溶液，颗粒尺寸满足不同波长发光要求。
通过在纳米颗粒表面自组装亲水性活性端基，可以制备水溶性、单分散、可 交联的量子点乳液，具体方法已有许多文献报道，满足高荧光效率和均匀性要求 的典型方法有1、用氨基硫醇作为表面活性分子，溶入金属盐的水溶液中，通 入VI族元素氢化物气体，反应结束后回流加热到沸点，通过调节加热时间来得 到不同尺寸的纳米颗粒，然后将反应产物用丙醇沉淀，反复洗涤，得到水溶性、 单分散、表面为氨基的半导体纳米颗粒(N. Gaponik et al， J. Phys. Chem. B, 2002， 106,7177) ;2、将VI族元素单质和金属有机化合物溶入磷酸三辛脂中，在把含 VI族元素的磷酸三辛脂同三正辛基氧膦混合，加热到300度左右，加入含金属 有机化合物的磷酸三辛脂，反应得到半导体纳米颗粒，通过改变高温保持时间来 调节纳米颗粒尺寸，再在较低温度下通入另一种VI族元素氢化物气体，得到高
发光效率的核/壳结构半导体量子点(I. Mekis et al， J. Phys. Chem. B, 2003, 107， 7454)，将该包覆有磷酸三辛脂的纳米颗粒溶入有机溶剂(苯、甲苯、氯仿、正 己烷等，)加入巯基羧酸的甲醇溶液，加入超纯水，萃取得到得到水溶性、单分 散、表面为羧基的核/壳结构半导体纳米颗粒(S.F.Wuister et al,Nano Letters, 2003, 3， 503)。
水相液滴的直径通过调整单根或多根毛细管以一定间距平行排列的直径以 及围绕毛细管以平行毛细管方向流动的连续油相的速度来调整，载入水相的油相 通过回流泵循环，油相中溶解的水通过用透析膜分隔的干燥剂来脱水，保证分散 在油相中水滴的水分子迅速扩散，包含在水滴中的纳米颗粒受表面张力约束而聚 集，形成球形聚集体。微球的大小通过调节溶解在水相中的纳米颗粒浓度和注入 油相的水相液滴直径来调节，由于微球内纳米颗粒近似密集排列，微球的直径
Z)、.=(0.11-0.13)A^^，其中Ds为微球的直径(微米)，p为量子点材料的密度 V户
(克/厘米:')，Me为量子点胶体溶液中量子点材料的质量摩尔浓度，Dd为注入油 相液滴的直径(微米)。
为了减小微球间可能的团聚，加入到油相中纳米颗粒数应小于1微摩尔浓 度。为了连续制备纳米尺寸微球，选用的油相对水的溶解度在2%到10%之间，为 了避免油相中液滴粘附在容器底部或侧壁，采用二元混合溶剂，调节比例使得其 密度与水相等，容器和回流管均采用疏水材料。为了稳定微球中的纳米颗粒，在 油相中球形聚集体形成后，在油相中加入偶联分子使微球中纳米颗粒交联，当纳 米颗粒表面修饰分子端基为氨基时，偶联分子为二元醛，二元醛可以是丙二醛到 辛二醛的任一种；当纳米颗粒表面修饰分子端基为羧基时，偶联分子为二胺，二 胺可以是乙二胺到丁二胺的任一种，偶联分子在油相中含量不低于1%体积比； 然后加入三倍偶联分子含量的表面钝化分子(偶联分子为二醛时加入正丙胺，偶 联分子为二胺时加入正丙醛)，待反应结束后取出反应器中分散有微球的油相溶 液，离心分离，用超纯水洗涤，重复若干次，即可得到悬浮于水中的量子点微球 胶体溶液。
实施例1:
将2. 35mmol Cd(ClO4)2'2H20溶解在125ml水中，在不停搅拌下加入5. 7mmo1 的氨基硫醇，并通过加入1MNaOH溶液来调节体系的pH值到5~7。向体系通氮
气约30min以确保排尽空气。在不断搅拌下，H2Te气体(由0. 46mmol Al2Te3与 15~20ml的0.5M 112804在氮气环境下反应生成)经氮气缓慢带动下通入反应体 系内20min，在空气环境下，将体系回流加热至l(KTC，得到氨基硫醇包覆的CdTe 纳米颗粒。
在该纳米颗粒水溶液加入超过30%体积比的丙醇，离心，去除上清溶液，用 丙醇重复洗涤6次以上，加入超纯水，得到去除杂质的单分散纳米颗粒水溶液。 实施例2:
在充有高纯氮的手套箱中将0.158g硒粉溶入2ml磷酸三辛脂，把0. 12g醋 酸镉溶入3ml磷酸三辛脂，将8克三正辛基氧膦在真空环境下加热到18(TC保持 1小时，降温到IO(TC，加入5g十六胺和0.15g正十四烷基磷酸，在真空环境下 12(TC保持20分钟，在反应器中充入流动氮气，把溶有硒粉的磷酸三辛脂加入到 混合物中，加热到30(TC，注入溶有醋酸镉的磷酸三辛脂，在26(TC保持不同时 间(5分钟到1小时)，得到不同颗粒尺寸的CdSe纳米颗粒，降温到140'C，停 止氮气，以每10分钟2ml的速度在液面上通过H2S气体，搅拌溶液，保持30分 钟，降温到10(TC，搅拌1小时，停止加入H2S气体，降温到5(TC，加入氯仿， 降到室温后，在溶液中加入甲醇，得到CdSe/CdS核/壳结构纳米颗粒沉淀，将沉 淀物溶入氯仿中，将溶液中加入0.05mol的巯基丙酸和氢氧化钾(过量20W混 合溶液，离心，去除上清溶液，加超纯水，重复洗涤6次以上，得到去除杂质的 单分散纳米颗粒水溶液。
实施例3:
按图一所示设计制备装置，油相溶剂为2: 1体积比的分析纯乙酸乙酯和1-2 丙二醇碳酸脂混合溶液，总体积为200ml,容器和回流管均采用聚四氟乙烯材料， 回流泵采用不锈钢齿轮泵，流量范围1.3 2.6ml/sec,取上述量子点水溶液，调 整浓度到1微摩尔，利用微量注射泵注入毛细管(图1)中，调节流量为 0. 5~2. 5ml/min，注入15秒，间隔5分钟；共轴毛细管喷头采用疏水处理的玻 璃材料，毛细管内径0. l画，外径0. 2mm，外管内径d为lmm，毛细管端头平整，端 头距外管开口距离h为lmm，外管端头为锥形，张角a为15° ，毛细管置于外管 中央，轴线同外管共轴；吸水剂采用纯化处理的聚丙烯酸树脂，颗粒度在0. 1 lmm 之间，透析膜为纤维素材料，截留分子量为l万，透析膜将吸水剂有效密封，吸
水剂的用量应保证在图1所示结构和上述溶剂体积下，吸水速度大于2.5ml/ miri。上述装置连续运行，可以大量制备量子点微球(图2);在油相中球形聚集 体形成后，当量子点表面修饰分子端基为氨基时，在油相中加入1%体积比的戊 二醛，当量子点表面修饰分子端基为羧基时，在油相中加入1%体积比的丁二胺， 作为固定微球中纳米颗粒的偶联分子，回流加热到70'C，慢速搅拌4小时后， 加入3%体积比的表面钝化分子(偶联分子为二醛时加入正丙胺，偶联分子为二 胺时加入正丙醛)，继续搅拌l小时，取出油相溶液，离心分离，用超纯水洗涤， 重复3次，得到均一尺寸高发光效率单分散量子点微球。
权利要求
1.一种均一尺寸纳米颗粒荧光微球的制备方法，其特征在于该制备方法为将构成微球的荧光纳米颗粒胶体水溶液的浓度调整到微摩尔量级，得到在水溶液中分散均匀的胶体溶液；以0.5～1.25％Vs/min的速度将上述水溶液中分散均匀的胶体溶液通过毛细管注入油相溶剂中形成液滴，Vs为油相溶剂的体积；毛细管内径在0.5到1.5mm之间，每注入10秒，间歇5分钟，回流溶剂的流速为0.6～1.3％Vs/sec，流速误差小于5％；油相溶剂采用二元或多元混合物，其对水的溶解度在2％到10％之间，混合物密度等于水的密度；容器和回流管采用疏水材料；液滴中的水被油相吸收，纳米颗粒聚集成密集球形；用吸水剂连续吸收油相中溶解的水，使油相中水含量远低于饱和；被通过调节量子点胶体溶液的浓度和回流泵流速，得到尺寸在几十到几百纳米，球形度高于5％，尺寸偏差小于10％的纳米颗粒聚集体；使用的构成微球荧光纳米颗粒表面修饰有端基为氨基或羧基的分子，具体方法为用氨基硫醇通过共价结合吸附在纳米颗粒表面；或使用巯基有机酸置换高温油相法得到的核/壳结构量子点表面修饰的TOPO分子；所述微球的结构为纳米颗粒被分子偶联形成的密集聚集体，偶联方法为在微球形成后的油相中加入偶联分子，充分反应后，再在油相中加入钝化分子，反应结束，对油相重复进行离心分离，洗涤，得到稳定的悬浮于水中的单分散量子点荧光微球。
2. 根据权利要求1所述的均一尺寸纳米颗粒荧光微球的制备方法，其特征在 于所述构成微球的荧光纳米颗粒为水溶性量子点结构，是CdS、 CdSe、 ZnS、 CdTe 材料的纳米颗粒或核/壳结构复合纳米颗粒，或是这些纳米颗粒的多元组合,或是 这些材料同磁性纳米颗粒的多元组合，纳米颗粒在超纯水中形成单分散胶体。
3. 根据权利要求1所述的均一尺寸纳米颗粒荧光微球的制备方法，其特征在 于通过毛细管注入油相的胶体溶液液滴的尺寸通过调整单根或多根毛细管阵列 的直径以及在共轴毛细管外平行流动的连续油相的速度来调整，载入水相的油相 通过回流泵循环，油相中溶解的水通过用透析膜分隔的高效吸水剂来脱水，吸水 剂不溶于水和油相溶剂，吸水速度大于lmg/min。
4. 根据权利要求1所述的均一尺寸纳米颗粒荧光微球的制备方法，其特征在于所述微球的尺寸通过调节溶解在水相中的纳米颗粒浓度和注入油相的水相液滴直径来调节，纳米颗粒是密集排列，微球的直径等于<formula>see original document page 3</formula>，其中Ds为微球的直径，单位为微米；p为量子点材料的密度，单位为克/厘米3； M。为量子点胶体溶液中量子点材料的质量摩尔浓度；Dd为注入油相液滴的直径， 单位为微米。
5.根据权利要求1所述的均一尺寸纳米颗粒荧光微球制备方法，其特征在于 微球中包含的的纳米颗粒表面用端基为氨基或羟基的分子修饰，并用偶联分子对 纳米颗粒进行交联，当纳米颗粒表面修饰分子端基为氨基时，偶联分子为二元醛， 二元醛是丙二醛到辛二酸的任一种；当纳米颗粒表面修饰分子端基为羧基时，偶 联分子为二胺，二胺是乙二胺到丁二胺的任一种，偶联分子在油相中含量为1% 体积比；其后在油相中加入约3%体积比钝化分子对微球表面钝化，偶联分子为 二醛时钝化分子为正丙胺，偶联分子为二胺时钝化分子为正丙醛。
全文摘要
均一尺寸纳米颗粒荧光微球的制备方法为将构成微球的荧光纳米颗粒胶体水溶液的浓度调整到微摩尔量级，得到在水溶液中分散均匀的胶体溶液；以0.5～1.25％V<sub>s</sub>/min的速度将上述水溶液中分散均匀的胶体溶液通过毛细管注入油相溶剂中形成液滴，V<sub>s</sub>为油相溶剂的体积；油相溶剂采用二元或多元混合物，其对水的溶解度在2％到10％之间，混合物密度等于水的密度；容器和回流管采用疏水材料；液滴中的水被油相吸收，纳米颗粒聚集成密集球形；用吸水剂连续吸收油相中溶解的水，使油相中水含量远低于饱和；被通过调节量子点胶体溶液的浓度和回流泵流速，得到尺寸在几十到几百纳米，球形度高于5％，尺寸偏差小于10％的纳米颗粒聚集体。
文档编号C09K11/00GK101342472SQ200810021960
公开日2009年1月14日 申请日期2008年8月20日 优先权日2008年8月20日
发明者周成喜, 龙 巴, 朱庆文 申请人:东南大学