金量子点的制备方法及其应用与流程

本发明属于材料应用技术领域，具体涉及一种牛血清白蛋白包被的金量子点的制备方法，并将其应用于植物细胞和组织的活体成像。

背景技术：

纳米材料是指在三维空间中至少有一个维度的尺寸处于1-100 nm之间或由小于100 nm的基本单元组成的材料。随着纳米科学与技术的快速稳步发展，纳米材料已经广泛应用于农业、医药、食品、化妆品、日用品等众多领域中。然而在生产、使用和处理等过程中纳米材料会不可避免地被传播到生态环境当中，进一步可能对生物体和生态环境造成不可预知的影响，因而纳米材料的环境行为及其毒性效应已经引发研究人员的广泛关注。植物是生态系统的生产者，在很大程度上会接触并吸收分散在环境中的纳米材料，从而使纳米材料进一步通过食物链进入到动物甚至人体中，因而越来越多的人侧重于探索纳米材料对植物的影响。

金量子点（AuNCs）是一种新型的荧光纳米材料，通常由几个到一百个金原子组成，尺寸小于2 nm。它们具有荧光强度大、毒性低、水溶性良好、生物相容性高等优点，因而在生物传感和生物成像等方面应用广泛。目前关于金量子点在细胞中成像的应用目前仅在动物细胞中有报道，而对于金量子点在植物中活体成像的研究并未见相关报道。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种金量子点的制备方法及其应用。

本发明技术方案是：

所提供的用于植物活体成像的金量子点，具体可按照包括如下步骤的方法制备和纯化得到：

（a1）将50 mL的氯金酸(HAuCl₄)水溶液（10 mM，37℃）加入到50 mL 的牛血清白蛋白（BSA）水溶液（50 mg/L，37℃）中，搅拌5 min后加入5 mL 的氢氧化钠（NaOH）水溶液（1 mol/L），37℃水浴反应12 h。

（a2）将制得的金量子点14，000 r/min离心30 min，取上清加入到透析袋（截留分子量为14 kDa）中透析4天，之后用孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，4℃放置备用。

本发明提供一种检测金量子点稳定性的方法。具体包括pH稳定性及H₂O₂稳定性的检测：

（1）pH稳定性检测：将纯化稀释后的金量子点分别用1M HCl和1M NaOH调成pH为4，5，6，7，8，9，10的水溶液，利用荧光分光光度计检测其在480 nm激发波长下的荧光强度。

（2）H₂O₂稳定性分析:向金量子点中加入适量的H₂O₂，使H₂O₂终浓度为1、10、100和1000 mM，利用荧光分光光度计检测金量子点在480 nm激发波长下的荧光强度。

本发明还提供将制备的金量子点应用于植物活体成像的方法。包括如下具体步骤：

（1）金量子点处理植物：我们选择未萌发的种子进行金量子点处理，玉米种子先用70%乙醇处理2 min，再用无菌水清洗5次。将不同浓度的金量子点（50、100、200、400 mg/L）以5 mL/皿的量加入到培养皿中（含单层滤纸），每个培养皿均匀地放入10粒种子，每个处理3个重复，空白对照用超纯水处理。将培养皿放置于人工气候室中，设定温度为25℃，湿度为80%，光照为24 h黑暗。

（2）玉米根部细胞压片、组织切片及荧光显微观察：暴露结束后，将玉米植物根用超纯水冲洗，切取根尖（约0.5 mm长）进行压片处理并在荧光显微镜（尼康公司，日本）下观察。同时取根部成熟区用5%琼脂糖包埋，用LEICA VT1000 S振动切片机（徕卡公司，德国）对其进行横切。横切后玉米组织样品直接在荧光显微镜下观察。

附图说明

图1为金量子点的形态及表征，其中a图为金量子点的高分辨透射电子显微镜图像；b图为金量子点的粒径分布图；c图为金量子点的UV-Vis吸收（黑线）及荧光光谱（红线，激发波长为480 nm）；d图为日光和紫外灯(365 nm)下金量子点的照片。制备的金量子点呈圆球形颗粒，平均粒径为2.05±0.41 nm，在480 nm激发下于638 nm处有吸收峰，且在紫外灯（365 nm）下呈鲜红色。

图2为金量子点的pH稳定性，其中a图为pH为4-10的金量子点在日光下的照片；b图为pH为4-10的金量子点在紫外灯（365 nm）下的照片；c图为pH为4-10的金量子点在不同时间段的荧光光谱（激发波长为480 nm）。金量子点在pH为8时荧光强度最大，随着pH的增大或减小，金量子点的荧光强度逐渐减弱。当pH>7时，荧光强度随着时间的增加先上升再下降，当pH<7时，荧光强度随着时间的增加先波动性下降后趋于平稳。

图3为金量子点在不同浓度过氧化氢(1、10、100、1000mM)中1天之后的荧光曲线，H₂O₂能使金量子点荧光淬灭，浓度越大，金量子点荧光强度越弱，且随着时间的增加荧光强度逐渐降低。终浓度为100mM和1000mM的H₂O₂能使金量子点荧光完全淬灭。

图4为玉米的活体成像，其中a图为超纯水处理玉米第三天根部细胞压片(40×物镜)；b图为400 mg/L金量子点处理玉米第三天根部细胞压片(40×物镜)，从中可以看到400 mg/L金量子点处理后玉米的根尖脱落细胞中存在红色荧光物质，说明金量子点可以穿透玉米细胞的细胞壁和细胞膜，进入根尖脱落细胞内。c图为400 mg/L金量子点处理玉米第三天根的横切图（4×物镜）；d图为400 mg/L金量子点处理玉米第三天根的横切图（20×物镜）。自发荧光呈蓝色，金量子点荧光呈红色。图中可以看到在金量子点处理的玉米根成熟区的皮层细胞中也存在少量红色荧光物质，说明金量子点能够进入玉米根部。

具体实施方式

在下面的具体实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

试剂：氯金酸（AuCl₃·HCl·4H₂O，分析纯）购自上海试剂一厂，牛血清白蛋白（BSA，分析纯）购自北京克尔慧科技有限公司，琼脂糖（Biowest Agarose）购自基因有限公司，氢氧化钠（NaOH）,浓盐酸（HCl），浓硝酸（HNO₃），过氧化氢（H₂O₂）均为分析纯，购自北京化工厂。

材料：试验材料为北京德农种业有限公司提供的玉米杂交种郑单958，发芽率≥95%，使用前保存在室温下干燥黑暗的环境中。

仪器及用具：DF-101Z集热式恒温加热磁力搅拌器（河南省予华仪器有限公司）、RXZ智能型人工气候箱（宁波江南仪器厂）、台式高速离心机（SIGMA公司，德国）、Milli-Q超纯水机（Millipore公司，美国）、SW-CJ-1F洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、Thermo NanoDrop 1000分光光度计（Nanodrop，美国）、Cary Eclipse荧光分光光度计（瓦里安公司，美国）、SX-300高压蒸汽灭菌锅（KAGOSHIMA SEISAKUSYO公司，日本）、尼龙66JTSF针筒式滤膜过滤器（孔径0.22 μm，天津市津腾实验设备仪器有限公司）、一次性使用无菌注射器（带针，上海米沙瓦医科工业有限公司）、透析袋（截留分子量为14 kDa，生工生物工程股份有限公司，上海）、JEOL JEM-2100F高分辨透射电子显微镜（HR-TEM，日本电子株式会社，日本）、Zetasizer Nano ZS（马尔文仪器有限公司，英国）、荧光显微镜（尼康公司，日本）、LEICA VT1000 S振动切片机（徕卡公司，德国）、SB5200DT超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、移液器（Eppendorf公司，德国）、电子天平（梅特勒-托利多公司，上海）、Pordigy电感耦合等离子体原子发射光谱(LEEMAN，美国)等。

实施例1 金量子点的制备与纯化

实验制备和盛装试剂的玻璃容器均用王水浸泡处理并洗净晾干。将50 mL的氯金酸(HAuCl₄)水溶液（10 mM，37℃）加入到50 mL的牛血清白蛋白（BSA）水溶液（50 mg/L，37℃）中，搅拌5 min后加入5 mL 的氢氧化钠（NaOH）水溶液（1 mol/L），37℃水浴反应12 h。将制得的金量子点14，000 r/min离心30 min，取上清加入到透析袋（截留分子量为14 kDa）中透析4天，之后用孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，4℃放置备用。

实施例2 金量子点的表征

取少量金量子点溶液超声30 min后滴在铜网上，室温下干燥后用JEOL JEM-2100F高分辨透射电子显微镜（HR-TEM，日本电子株式会社，日本）对其进行表征。利用Nano Measure软件计算金量子点粒径大小。利用Zetasizer Nano ZS激光粒度仪（马尔文仪器有限公司，英国）测得金量子点的ζ电势。将纯化稀释后的金量子点（400 mg/L）用365 nm的紫外光照射观察其荧光颜色，并用Cary Eclipse荧光分光光度计（瓦里安公司，美国）测其在480 nm激发波长下的荧光光谱，利用Thermo NanoDrop 1000分光光度计（Nanodrop，美国）检测其UV-Vis吸收光谱。

结果如图1，制备的金量子点呈圆球形颗粒，平均粒径为2.05±0.41 nm，在480 nm激发下于638 nm处有吸收峰，且在紫外灯（365 nm）下呈鲜红色。利用Zetasizer Nano ZS激光粒度仪测得金量子点的ζ电势为-14.70±0.96，表明金量子点带负电荷。

实施例3 金量子点的稳定性分析

一、pH稳定性分析

将纯化稀释后的金量子点分别用1M HCl和1M NaOH调成pH为4，5，6，7，8，9，10的水溶液，利用荧光分光光度计测其在480 nm激发波长下的荧光强度。

结果如图2，金量子点在pH为8时荧光强度最大，随着pH的增大或减小，金量子点的荧光强度逐渐减弱。当pH>7时，荧光强度随着时间的增加先上升再下降，当pH<7时，荧光强度随着时间的增加先波动性下降后趋于平稳。

二、H₂O₂稳定性分析

向金量子点中加入适量的H₂O₂，使H₂O₂终浓度为1、10、100和1000 mM，利用荧光分光光度计检测金量子点在480 nm激发波长下的荧光强度。

结果如图3所示， H₂O₂能使金量子点荧光淬灭，浓度越大，金量子点荧光强度越弱，且随着时间的增加荧光强度逐渐降低。终浓度为100mM和1000mM的H₂O₂能使金量子点荧光完全淬灭。

实施例4

1.金量子点对玉米的暴露处理

玉米种子(郑单958，北京德农种业有限公司)先用70%乙醇处理2 min，再用无菌水清洗5次。将不同浓度的金量子点（50、100、200、400 mg/L）以5 mL/皿的量加入到培养皿中（含单层滤纸），每个培养皿均匀地放入10粒种子，每个处理3个重复，空白对照用超纯水处理。将培养皿放置于人工气候箱中，设定温度为25℃，湿度为80%，光照为24 h黑暗。

2.玉米根部细胞压片、组织切片及荧光显微观察

暴露结束后，将玉米植物根用超纯水冲洗，切取根尖（约0.5 mm长）进行压片处理并在荧光显微镜（尼康公司，日本）下观察。同时取根部成熟区用5%琼脂糖包埋，用LEICA VT1000 S振动切片机（徕卡公司，德国）对其进行横切。

压片及切片结果如图4。压片结果表明：金量子点可以穿透玉米细胞的细胞壁和细胞膜，进入根尖脱落细胞内。切片结果显示在金量子点处理的玉米根成熟区的皮层细胞中也可以观察到少量红色荧光物质，说明金量子点能够进入玉米根部。