一种基于离子印迹的比率荧光探针及其制备与应用的制作方法

本发明涉及一种针对水中镉离子检测的快速可视化比率荧光探针的制备与检测方法。

(二)

背景技术：

镉是一种有毒重金属，普遍存在于工业、被污染的农产品以及我们日常生活中。当环境受到镉污染后，镉可在生物体内富集。镉可以通过食物链进入人体，与蛋白质上的巯基结合，形成镉硫蛋白，选择性地蓄积肝、肾中，造成一系列急、慢性疾病，如骨质疏松、肺癌等。因此我们迫切需要发展一种方便可行的方法来检测Cd²⁺。传统的Cd²⁺检测方法，如原子吸收光谱、电感耦合等离子质谱、粒子诱发X射线荧光分析、色谱法和伏安法测试费高，样品前处理复杂，测试时间长。

采用荧光的方法来检测重金属离子具有简单方便、灵敏度高、响应时间短等优点，常常用于快速可视化检测。然而，目前大多数的荧光探针只用单一的化学信号来进行检测，检测时，容易受到入射光、探针浓度以及环境变化的影响，而造成结果失真，灵敏度下降。近年来，科学工作者们发展了比率型探针。比率探针拥有两个互相独立的信号，既提高了灵敏度，又实现了自我矫正和可视化识别分析物的功能。有机染料和量子点常常用来提供比率探针的荧光信号，相比于有机染料，量子点具有量子效率高、耐光性好、发射光谱窄而对称、吸收光谱宽、尺寸可控等优点。因此，在过去的几年中，基于量子点的比率探针得到了较快的发展，并常用于检测金属离子。

截至目前，有关镉离子的比率探针的中国专利报道有(CN102936501A)，该方法是一种“关/开”模型探针。该探针检测镉离子时，无法有效地区分锌离子与镉离子。分子印迹是用来提高选择性的一种好方法，可以用来特异性识别化合物。分子印迹探针具有稳定性好、制备简单、价格便宜等优点，近年来常常用来检测农药、杀虫剂、爆炸物等。受此启发，为了提高镉离子检测的选择性，我们设计合成了一种离子印迹探针。据我们了解，目前还没有报道过基于离子印迹的量子点比率荧光探针来检测镉离子。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是克服目前基于量子点的镉离子探针的不足，提供一种制备简单，成本低廉，检测方便，选择性较好的检测镉离子的比率荧光探针，实现对镉离子的选择性快速可视化检测。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种基于离子印迹的比率荧光探针，所述荧光探针以红色量子点为核心并包埋于二氧化硅纳米粒中，再对二氧化硅纳米粒表面进行氨基化修饰，然后再在氨基化修饰后的表面共价偶联上绿色量子点，得到基于离子印迹的比率荧光探针。

进一步，优选所述红色量子点为碲化镉量子点。

进一步，优选所述绿色量子点为硒化镉量子点。

进一步，优选所述包埋二氧化硅纳米粒的红色量子点粒径为40-100nm，优选40～60nm。

本发明还提供一种所述基于离子印迹的比率荧光探针的制备方法，所述方法为：(1)将红色量子点分散于氨水(质量浓度25％)、氢氧化钠和去离子水中，5～45℃搅拌0.1～1h(优选25℃搅拌0.5h)，形成量子点碱溶液；所述红色量子点与氢氧化钠质量比为1：0.2～1(优选1:0.6)，所述氨水体积用量以红色量子点质量计为4～40ml/g(优选22ml/g)，去离子水体积用量以红色量子点质量计为500～1000ml/g(优选978ml/g)；(2)将环己烷、正己醇和曲拉通混合并搅拌至透明，然后加入5～20mM聚二烯二丙基氯化铵水溶液及氨水(质量浓度25％)，形成微乳体系；所述微乳体系中，环己烷、正己醇、曲拉通、聚二烯二丙基氯化铵水溶液及氨水的体积终浓度分别为60～90％、6～20％、10～25％、0.01～1％、0.1～1％；(3)将步骤(1)量子点碱溶液加入到步骤(2)微乳体系中，5～45℃搅拌10～60min(优选25℃搅拌0.5h)，形成反相微乳体系；然后向反相微乳体系中加入正硅酸四乙酯(TEOS)，接着5～45℃搅拌1～4天(优选25℃搅拌2d)后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，继续搅拌混合12～24h，离心，沉淀依次用异丙醇、无水乙醇、去离子水洗涤1～2次，得到包埋红色量子点的二氧化硅纳米粒子(即CdTe@SiO₂-NH₂)；所述量子点碱溶液与微乳体系体积比为1：5～30(优选1:11.17)；所述正硅酸四乙酯与量子点碱溶液体积比为0.01～2：1(优选0.1:1)；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷与量子点碱溶液体积比为0.001～0.1：1(优选0.01:1)；(4)将步骤(3)制备的包埋红色量子点的二氧化硅纳米粒子分散到去离子水中形成分散液，并加入绿色量子点和pH＝7.0的PB缓冲液，黑暗搅拌8个小时，离心，沉淀用去离子水洗涤，获得所述基于离子印迹的镉离子比率荧光探针；所述绿色量子点与包埋红色量子点的二氧化硅纳米粒子质量比为0.05～1：1(优选0.3:1)，所述PB缓冲液体积用量以包埋红色量子点的二氧化硅纳米粒子质量计为10～100ml/g(优选38.4ml/g)。

进一步，优选步骤(1)所述红色量子点与氢氧化钠质量比为1：0.6～0.8，所述氨水体积用量以红色量子点质量计为20～25ml/g。

进一步，优选步骤(2)所述微乳体系中，环己烷、正己醇、曲拉通、聚二烯二丙基氯化铵水溶液及氨水的体积终浓度分别为60～70％、15～20％、15～18％、0.2～0.4％、0.5～0.6％。

进一步，优选步骤(3)所述量子点碱溶液与微乳体系体积比为1：10～15；所述正硅酸四乙酯与量子点碱溶液体积比为0.1～0.5：1；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷与量子点碱溶液体积比为0.01～0.02：1。

进一步，优选步骤(4)所述绿色量子点与包埋红色量子点的二氧化硅纳米粒子质量比为0.3～0.5：1，所述PB缓冲液体积用量以包埋红色量子点的二氧化硅纳米粒子质量计为35～40ml/mg。

此外，本发明还提供一种所述基于离子印迹的比率荧光探针在检测镉离子中的应用。具体方法为：200μL浓度区间0～0.2g/ml的比例探针，pH区间6.0～10.0的Tris-HCl缓冲液200μL及80μL浓度区间0～10μM的EDTA水溶液加入取样管中，加入含有浓度0～30μM的Cd²⁺的水样，最后用去离子水稀释到2mL，10分钟后在与上述相同的检测条件下进行荧光测试。

为了进一步探究本发明基于离子印迹的镉离子比率荧光探针的选择性，我们在探针的分散液中加入一系列的金属离子，包括Zn²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、K⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Ag⁺和Mn²⁺，并进行荧光光谱检测，相比之下，Mg²⁺、Ba²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、K⁺、Ca²⁺和Zn²⁺对离子印迹探针的荧光影响不大，Cu²⁺、Hg²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Mn²⁺会造成荧光的猝灭，荧光颜色变成深红色。因此，我们合成的比率探针仍然能够选择性地检测Cd²⁺。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

1、利用反相微乳法制备红光发射的包埋量子点的二氧化硅纳米粒子，相比stober方法，具有更好的分散性，有利于红光发射的包埋量子点的二氧化硅纳米粒子表面绿色量子点层的构建，并将量子点形成碱溶液，进行孵化，提高了荧光性能。

2、采用双稳定的CdSe量子点作为表层量子点，相比传统的碲化镉量子点，探针稳定性好。

3、相比其它的比率探针，本探针在检测时，基于量子点的比率型离子印迹来检测金属离子，具有相当优秀的特异性。并且稳定性好、制备简单、价格便宜等优点，而且大大缩短了反应时间，对镉离子的检测低至25nM，对快速可视化检测提供了方便。

(四)附图说明

图1为实施例1中红光发射的包埋量子点的二氧化硅纳米粒子的TEM图。

图2为实施例1中比率探针的TEM图。

图3为实施例3中荧光光谱图。

图4为实施例3中365nm紫外灯下相应的荧光照片，从左至右Cd²⁺浓度依次为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9μM。

图5为实施例4中荧光光谱图。

图6为实施例4中365nm紫外灯下相应的荧光照片，从左至右依次为空白、10μM的Cd²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、K⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Mn²⁺。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例所用聚二丙烯二乙基氯化铵分子量均为100000～200000。

实施例1：

1、红色量子点的制备

将0.2284g氯化镉(CdCl₂·2.5H₂O)加入到500mL去离子水中，通氮气20min，随后加入0.1mL巯基丙酸，再用1M的氢氧化钠水溶液调节pH至11.00，然后继续加入0.538g柠檬酸钠(含结晶水)，0.0444g亚碲酸钠，0.2g硼氢化钠，最后进行加热回流。回流8h后得到发射红色荧光的巯基丙酸稳定的碲化镉量子点水溶液(即红色量子点溶液)，发射峰在628纳米，浓度为4.3×10^-6mol/L。

取4mL已合成的红色量子点溶液，加入4mL无水乙醇，静置沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤1～2次，获得碲化镉红色量子点3mg。

2、包埋红色量子点的二氧化硅纳米粒子

取1mg红色量子点分散于0.022ml氨水(25wt％)和0.6mg氢氧化钠，0.978mL的去离子水中，25℃搅拌30min，即为红色量子点碱溶液1ml，其中氨水质量终浓度为0.6wt％，氢氧化钠终浓度为15.9mmol/L，红色量子点终浓度为1mg/ml。取环己烷7.5mL，正己醇1.8mL，曲拉通1.77mL混合并搅拌形成透明混合溶液，然后在透明混合溶液中加入60μL氨水(25wt％)，40μL浓度为1.78mmol/L的聚二烯二丙基氯化铵水溶液，形成微乳体系11.17ml。然后将红色量子点碱溶液1ml加入到上述11.17ml微乳体系中，25℃搅拌30min，得到透明的反相微乳体。然后向反相微乳体系中加入100μL正硅酸四乙酯，25℃搅拌两天后加入10μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，继续搅拌24h后离心，沉淀依次用异丙醇、无水乙醇、去离子水洗涤1～2次，得到包埋红色量子点的二氧化硅纳米粒子(即CdTe@SiO₂-NH₂)0.012g，粒径40～60nm(形貌图见图1)。将得到的包埋红色量子点的二氧化硅纳米粒子分散在去离子水中，备用。

3、基于离子印迹的镉离子比率荧光探针

2mL的CdSe水溶液(来源于5mL CdSe量子点原液加水稀释，质量为0.004g)加入到2mL CdTe@SiO₂-NH₂(13mg)分散液中，接着加入0.5mL pH＝7.0的缓存PB缓冲液，在黑暗条件下搅拌8h。反应结束后，离心，取沉淀并用去离子水洗涤3次，除去多余的量子点，得到1mg/ml的CdTe@SiO₂@CdSe比率探针，365nm紫外灯下，荧光呈绿色(形貌图见图2)。最后将得到的CdTe@SiO₂@CdSe纳米微球分散在去离子水中，并保存在4℃的冰箱中，备用。

实施例2：

1、红色量子点的制备

将0.2284g氯化镉(CdCl₂·2.5H₂O)加入到500mL去离子水中，通氮气20min，随后加入0.1mL巯基丙酸，再用1M的氢氧化钠水溶液调节pH至11.00，然后继续加入0.538g柠檬酸钠(含结晶水)，0.0444g亚碲酸钠，0.2g硼氢化钠，最后进行加热回流。回流8h后得到发射红色荧光的巯基丙酸稳定的碲化镉量子点水溶液(即红色量子点溶液)，发射峰在628纳米，浓度为4.3×10^-6mol/L。

取4mL已合成的红色量子点溶液，加入4mL无水乙醇，静置沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤1～2次，获得碲化镉红色量子点3mg。

2、包埋红色量子点的二氧化硅纳米粒子

取1mg红色量子点分散于0.022ml氨水(25wt％)和0.8mg氢氧化钠，0.978mL的去离子水中，25℃搅拌30min，即为红色量子点碱溶液1ml，其中氨水质量终浓度为0.6wt％，氢氧化钠终浓度为21.2mmol/L，红色量子点终浓度为1mg/ml。取环己烷6.8mL，正己醇2.2mL，曲拉通2.0mL混合并搅拌形成透明混合溶液，然后在透明混合溶液中加入60μL氨水(25wt％)，40μL浓度为1.78mmol/L的聚二烯二丙基氯化铵水溶液，形成微乳体系11.1ml。然后将红色量子点碱溶液1ml加入到上述11.1ml微乳体系中，25℃搅拌30min，得到透明的反相微乳体。然后向反相微乳体系中加入500μL正硅酸四乙酯，25℃搅拌两天后加入20μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，继续搅拌24h后离心，沉淀依次用异丙醇、无水乙醇、去离子水洗涤1～2次，得到包埋红色量子点的二氧化硅纳米粒子(即CdTe@SiO₂-NH₂)0.012g，粒径40～60nm。将得到的包埋红色量子点的二氧化硅纳米粒子分散在去离子水中，备用。

3、基于离子印迹的镉离子比率荧光探针

2mL的CdSe水溶液(来源于8mL CdSe量子点原液，质量为0.0065g)加入到2mL CdTe@SiO₂-NH₂(13mg)分散液中，接着加入0.5mL pH＝7.0的缓存PB缓冲液，在黑暗条件下搅拌8h。反应结束后，离心，取沉淀并用去离子水洗涤3次，除去多余的量子点，得到1mg/ml的CdTe@SiO₂@CdSe比率探针，365nm紫外灯下，荧光呈绿色。最后将得到的CdTe@SiO₂@CdSe纳米微球分散在去离子水中，并保存在4℃的冰箱中，备用。

实施例3：

1、红色量子点的制备

将0.4568g氯化镉(CdCl₂·2.5H₂O)加入到500mL去离子水中，通氮气20min，随后加入0.2mL巯基丙酸，再用1M的氢氧化钠水溶液调节pH至11.00，然后继续加入1.076g柠檬酸钠(含结晶水)，0.0888g亚碲酸钠，0.4g硼氢化钠，最后进行加热回流。回流8h后得到发射红色荧光的巯基丙酸稳定的碲化镉量子点水溶液(即红色量子点溶液)，发射峰在628纳米，浓度为6.5×10^-6mol/L。

取2mL已合成的红色量子点溶液，加入2mL无水乙醇，静置沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤1～2次，获得碲化镉红色量子点2.8mg。

2、包埋红色量子点的二氧化硅纳米粒子

取1mg红色量子点分散于0.025ml氨水(25wt％)和0.6mg氢氧化钠，0.975mL的去离子水中，25℃搅拌30min，即为红色量子点碱溶液1ml，其中氨水质量终浓度为0.625wt％，氢氧化钠终浓度为15.9mmol/L，红色量子点终浓度为1mg/ml。取环己烷7.8mL，正己醇1.7mL，曲拉通1.7mL混合并搅拌形成透明混合溶液，然后在透明混合溶液中加入60μL氨水(25wt％)，40μL浓度为1.78mmol/L的聚二烯二丙基氯化铵水溶液，形成微乳体系11.3ml。然后将红色量子点碱溶液1ml加入到上述11.3ml微乳体系中，25℃搅拌30min，得到透明的反相微乳体。然后向反相微乳体系中加入500μL正硅酸四乙酯，25℃搅拌两天后加入10μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，继续搅拌24h后离心，沉淀依次用异丙醇、无水乙醇、去离子水洗涤1～2次，得到包埋红色量子点的二氧化硅纳米粒子(即CdTe@SiO₂-NH₂)0.012g，粒径40～60nm。将得到的包埋红色量子点的二氧化硅纳米粒子分散在去离子水中，备用。

3、基于离子印迹的镉离子比率荧光探针

2mL的CdSe水溶液(来源于5mL CdSe量子点原液，质量为0.004g)加入到2mL CdTe@SiO₂-NH₂(12mg)分散液中，接着加入0.5mL pH＝7.0的缓存PB缓冲液，在黑暗条件下搅拌8h。反应结束后，离心，取沉淀并用去离子水洗涤3次，除去多余的量子点，得到1mg/ml的CdTe@SiO₂@CdSe比率探针，365nm紫外灯下，荧光呈绿色。最后将得到的CdTe@SiO₂@CdSe纳米微球分散在去离子水中，并保存在4℃的冰箱中，备用。

实施例4：缓冲液中Cd²⁺的检测

在取样管中加入200μL浓度为0.5mg/mL的实施例1制备的比率探针去离子水悬液，200μL浓度为100mM、pH＝9的Tris-HCl缓冲液，以及80μL浓度为0.02mM的EDTA水溶液，接着加入不同终浓度的Cd²⁺(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9μM)，最后用去离子水稀释到2mL，并摇匀。10分钟后将混合液转移到3mL比色皿中进行荧光检测，根据取样管中颜色的对比，可以判断不同取样管中Cd²⁺的浓度，Cd²⁺的浓度越大，荧光越偏向于绿色(荧光图见图3，365nm紫外灯下相应的荧光照片见图4)。所有的操作均在室温下进行，荧光检测的条件如下：激发波长为380nm，激发光和发射光的狭缝宽度均为3nm，扫描范围从450nm到740nm。

实施例5：实际水体样品中Cd²⁺的检测

为了评估比率探针的实用性，我们用湖水和自来水两种实际水样进行Cd²⁺检测实验。实验中所用的湖水取自西湖音乐喷泉南方100米处的岸边，在实验前用0.22μm滤头过滤2次，除去西湖水中的悬浮物。自来水样品直接从实验室的水龙头中获得，不做任何前处理。实际检测时，将200μL浓度为0.5mg/mL的实施例1制备的比率探针去离子水悬液，200μL浓度为100mM、pH＝9的Tris-HCl缓冲液，以及80μL浓度为0.02mM的EDTA水溶液加入到取样管中，然后加入1mL含有不同浓度的Cd²⁺的自来水和西湖水样品(西湖水样品在使用之前先过滤掉水中的固体悬浮物，自来水样在使用前不经过任何处理，然后各自加入一定量的Cd²⁺，使样品含Cd²⁺浓度为2.0、5.0和8.0μM)，最后用去离子水稀释到2mL，10分钟后在与上述相同的检测条件下进行荧光测试，根据取样管的荧光颜色，即可判断Cd²⁺的浓度，Cd²⁺的浓度越大，荧光越偏向于绿色。

实施例6离子印迹比率探针的选择性

为了进一步探究Cd²⁺印迹比率探针的选择性，我们在探针的分散液中加入一系列的金属离子，包括Zn²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、K⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Ag⁺和Mn²⁺，并通过荧光光谱，记录下荧光比率的变化情况。

取14只取样管，在取样管中分别加入200μL浓度为0.5mg/mL的实施例1制备的比率探针去离子水悬液，0.01M、pH9.0的Tris-HCl缓冲液和80μL浓度为0.02mM的EDTA水溶液，接着以第一只取样管为空白对照，其他取样管中分别加入金属离子终浓度依次为10μM的Cd²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、K⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Mn²⁺，最后用去离子水稀释到2mL，并摇匀。10分钟后将混合液转移到3mL的比色皿中进行荧光检测(荧光光谱图见图5，365nm紫外灯下相应的荧光照片见图6)，通过相应的荧光照片，可以看出只有加了Cd²⁺的样品，荧光才由红色变到绿色，也相应证明了该离子印迹比率探针对Cd²⁺的选择性。