一种两亲性壳聚糖衍生物抗蛋白质吸附涂层的制备方法和应用与流程

本发明属于生物医用材料和高分子化学领域，具体涉及一种两亲性壳聚糖衍生物抗蛋白质吸附涂层的制备方法和应用。
背景技术：
：蛋白质是两亲性的大分子物质，在生命体中属于一种不可或缺的物质，有着极其丰富的生物功能。但由于蛋白质表面的亲和性，导致其易吸附在材料表面造成材料的污染，继而影响材料的性能，并产生一系列危害。在非生物方面，海洋生物吸附实质上是蛋白质吸附的问题，海洋生物如藤壶、贻贝、硅藻等分泌物中多含有大量的蛋白质和多糖，其分泌物易在材料的表体上吸附分散，从而污损海洋生物在材料表面上吸附生长且黏着更多的其他污损海洋物。对于海洋运输业来说，生物垢的产生导致船体自重加大，轮船的运输消耗增加且严重的腐蚀船体，降低船只的使用寿命。对于海洋养殖产业，海洋生物的附着易造成网箱养殖中的网眼堵塞，使养殖物缺氧致死，影响产率造成大量的经济损失。而在生物方面，对于生物材料植入人体内后，体内蛋白质开始吸附在材料上，引起体内不同程度的生物学反应，如血浆蛋白质附着在心血管植入物表面导致血管内血栓的形成；药物缓释的纳米粒子在体内循环中会被蛋白质吸附产生蛋白质电晕作用，导致纳米粒子被吞噬到不了靶细胞，药物疗效下降。对于常见的隐形眼镜的使用中，溶菌酶的吸附会导致眼睛的疾病。蛋白质的吸附还会引起生物传感器的测量误差，导致测量数据的不准确。蛋白质吸附性的危害存在于各个方面。因此，减少蛋白质的吸附性，研究具有优良的抗蛋白质特性的材料是当今材料、化学、生物等领域的研究重点。壳聚糖又名几丁聚糖，是由几丁质完全或部分脱乙酰化的产物，是第二大生物聚合物，来源广泛。壳聚糖有良好的生物可降解性，易被人类肠道通常存在的细菌菌群降解，其生物降解性随聚合物中乙酰胺基团比例的增加而增加，与几丁质不同，完全脱乙酰壳聚糖几乎不分解。壳聚糖具有丰富的亲水基团氨基和羟基，易进行化学改性，且安全无毒。研究者常在壳聚糖的结构单元上引入有利基团达到理想的化学改性效果，生成具有不同性质的壳聚糖衍生物，使其在化学、生物工程、食品工业、环境治理、皮肤组织修复等许多研究方向得到广泛的关注、研究及应用。但壳聚糖分子具有强亲水性，不溶于碱性及许多有机溶剂，ph使用范围小，易流失等缺点限制了它的广泛使用。目前，所研究的抗蛋白质吸附材料主要有以下几类：(1)基于地形异质性的抗蛋白质吸附材料，可产生具有高水平的地形异质性的超疏水表面，这种具有小突起的独特结构可以带来大量的空气滞留在水下，以减少液体和表面之间的接触面积，使蛋白质不能接近表面，这种超疏水表面最初是在莲花上观察到的，其自清洁性能是众所周知的，其优异的抗粘附能力是基于疏水性的蜡角质层和乳头表面结构。(2)基于两性离子聚合物的抗蛋白质吸附材料，现在，对含有两性离子聚合物材料的研究还处在开始阶段，由于两性离子聚合物的高极性，它只能溶解在高极性溶剂如水或乙醇中，与其它低极性单体共聚非常困难；另一方面，含两性离子聚合物的材料遇水后溶胀从而造成其机械强度降低以及在固体表面不容易固定等问题使得这些材料的性能有待于提高。(3)基于两亲性聚合物的抗蛋白质吸附材料，以两亲性聚合物为代表的具有微观相分离结构的抗蛋白质吸附材料具有抑制血小板吸附、阻止血小板变性、抑制血液凝聚等特点，最有望成为新一代血液相容性材料，目前已成为抗蛋白质吸附材料研究的前沿领域。抗蛋白质吸附材料的制备方法，一般采用物理吸附或共混，表面接枝，形成表面涂层等方法引入抗蛋白质吸附单元。抗蛋白质吸附材料主要应用于(1)生物医用材料：广泛应用于心血管系统，软组织修复，血液净化，药物及生物活性物控制释放和生物传感器等领域；(2)海洋防污材料：海洋微生物在船体或其它海洋设施表面上吸附、生长，并与其它海洋生物不断粘附而形成的生物垢，给海洋运输和海洋资源的勘探、开发、利用等造成巨大的危害，海洋防污实际是一个表面的抗蛋白质吸附问题。两亲性聚合物由于具有亲水性和低表面能以及具有可发生微相分离的两亲性特殊结构所以能够有效地抵抗蛋白质的吸附，作为抗蛋白质吸附材料越来越引起科学研究者的关注。目前报道的两亲性聚合物抗蛋白质材料，作为一种新型的抗生物污染材料展现了其独特的优势，一方面解决了常规的亲水性抗污材料在水环境下的不稳定性，从而不需要通过复杂的化学键结合的方法将分子链固定；另一方面可以通过改性的方法在一些不抗污染的疏水材料表面接枝一段亲水基团，从而扩大了许多材料的使用范围，目前已成为抗蛋白质吸附材料研究的前沿领域。研究两亲性聚合物抗蛋白质防污的专利和文献报道很多，其中两亲性壳聚糖抗蛋白质吸附的文献还未见报道。中国发明专利(cn101658484a）公开一种胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束的制备方法，该法利用胆固醇甲酰氯在壳聚糖氨基上链接胆固醇，在水性介质中自组装制备共聚物载药胶束。保护壳聚糖的氨基，在壳聚糖羟基上接上疏水长链得到两亲性壳聚糖，将得到的两亲性壳聚糖用于抗蛋白质研究的文献尚未见报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种两亲性壳聚糖衍生物抗蛋白质吸附涂层的制备方法和应用。该方法首先引入疏水性基团改变壳聚糖的亲水程度，得到两亲性壳聚糖衍生物，削弱其分子间氢键的影响，改变了壳聚糖的生物特性并拓宽了应用范围。对壳聚糖进行疏水改性时，由于壳聚糖分子链上的羟基和氨基均具有反应活性，但是氨基显示出更高的活性，为了保留氨基赋予壳聚糖的特性，必须在反应前对分子链上的氨基进行保护。该方法使用甲磺酸来进行氨基保护，然后壳聚糖羟基与胆固醇氯甲酸酯进行亲核取代得到两亲性的胆固醇壳聚糖酯。调控不同投料比的两亲性物质的亲疏水基团比例，探究最佳抗蛋白质效果。该方法通过引入疏水基团，提高了膜的两亲性能，使其抗蛋白质能力增强。同时实验方法简单，原料易得，有很好的应用前景。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明所述的一种两亲性壳聚糖衍生物抗蛋白质吸附涂层的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）胆固醇氯甲酸酯的活化在圆底烧瓶中，按顺序加入胆固醇氯甲酸酯（chol-cl）、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc），在一定温度下搅拌一段时间后得到无色澄清溶液a；（2）抗蛋白质的两亲性胆固醇壳聚糖酯（chcs）的合成在三口烧瓶中，加入壳聚糖（cs），随后加入甲磺酸，通氮气除氧气后封口，搅拌至壳聚糖完全溶解，在氮气保护下，逐滴加入步骤（1）制备的溶液a，反应过程不断有沉淀析出，反应在一定温度条件下搅拌一定时间；反应结束后将上述混合物倒入大量沉淀剂中，产物经离心后洗涤，再将所得的洗涤产物通过溶解-沉淀方式进行提纯后，抽滤，冷冻干燥得到米白色固体状的胆固醇壳聚糖酯（chcs）；（3）利用langmuir技术研究chcs在空气/水界面单分子膜行为用微量进样器移取50-300µl1.0mg/ml的chcs氯仿溶液，在langmuir-blodgett（lb）槽体的正上方缓慢滴加至亚相水面上，使其更好的铺展在水面上；等待5-30min至成膜分子全部扩散且氯仿挥发后，手动归零天平压力，设置滑障速度为10-200cm2/min，压缩滑障，得到有序密集排列的单分子膜的表面压（π）与平均分子面积（a）等温曲线；π-a等温曲线显示chcs单分子膜的压缩过程表面压呈现先缓慢增加到急剧增加，而后下降的变化过程；chcs单分子膜成膜性能良好，能在水相上稳定存在，从而说明chcs具有良好的两亲性；（4）抗蛋白质吸附实验将一定量cs或步骤（2）制得的chcs配制成一定浓度的溶液，利用匀胶机在基板上旋涂膜，干燥并预处理后备用；将预处理后的涂层浸入不同浓度的蛋白质溶液中，在一定条件下，吸附一段时间后，利用bca法测定吸附前后蛋白质溶液浓度的变化，根据浓度变化值计算出蛋白质的吸附量，进而得出抗蛋白质吸附率。上述步骤（1）中所述的胆固醇氯甲酸酯与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为：1:1～3，n,n-二甲基甲酰胺加入量为50～200ml；步骤（1）中所述的反应条件为25～50℃，搅拌2～6h得到无色澄清溶液a。上述步骤（2）中所述的壳聚糖与甲磺酸溶剂比例为：0.1g:5～100ml；步骤（2）中所述的反应温度为25～80℃，搅拌时间12～120h。上述步骤（1）中所述的胆固醇氯甲酸酯与步骤（2）中所述的壳聚糖重复单元摩尔比为：0.01～7:1。上述步骤（2）中所述的粗产物提纯用到的沉淀剂为水、甲醇、乙醇中一种或多种组合，用沉淀剂提纯后的产物经离心后洗涤，再将所得的洗涤产物通过氯仿溶解-甲醇沉淀的方式提纯后进行抽滤，冷冻干燥。上述步骤（4）中所述的将一定量cs或步骤（2）制得的chcs配制成一定浓度的溶液是用溶剂配制成浓度为1～50mg/ml的溶液，所述溶剂为醋酸-水溶液、四氢呋喃、氯仿、乙醇中一种或多种组合。上述步骤（4）中所述的基板为玻片、硅片、金属、塑料、纤维或木材，旋涂膜条件为：转速为1000～5000r/min，时间为20～100s，cs和chcs用量50～1000µl。上述步骤（4）中所述的涂层的预处理的步骤是：将干燥好的csch或cs涂层或空白洁净的基板分别用10～100wt%的酒精浸泡1～10min，再用蒸馏水冲洗去除残留的酒精，然后浸入到1～10ml0.01～0.2m、ph=7.0pbs溶液中浸泡1～5h。上述步骤（4）中所述的不同浓度的蛋白质溶液是用pbs与蛋白质配制的，不同浓度的蛋白质浓度在0.01～20mg/ml，蛋白质溶液需现配现用，所述蛋白质为牛血清白蛋白、人血清蛋白、溶菌酶、小鼠免疫球蛋白、乳铁蛋白、纤维蛋白原、肌红蛋白、牛血红蛋白、刀豆蛋白、胶原蛋白中的一种或多种组合。本发明上述的一种两亲性壳聚糖衍生物抗蛋白质吸附涂层的制备方法制得的抗蛋白质吸附涂层的应用，其特征在于，在20～40℃时，将预处理好的csch或cs涂层或空白洁净的基板分别浸泡在1～10ml蛋白质溶液中进行蛋白质吸附，1～5h后取出样品；所述的bca法是指二价铜离子在碱性条件下被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子与bca试剂形成紫色复合物，该复合物在562nm处显示强烈的吸收光，吸光值和蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系，根据吸光值利用bca法测样品蛋白质浓度，在酶标仪或紫外可见分光光度计上测定试样吸附蛋白质前后的蛋白质溶液在562nm处的吸光值，根据工作曲线从吸光值的大小得到吸附前后蛋白质的浓度，根据浓度变化计算出蛋白质的吸附量,进而计算出抗蛋白质吸附率。具体地说，本发明采用如下技术方案：一种两亲性壳聚糖衍生物抗蛋白质吸附涂层的制备方法，包括以下步骤：（1）胆固醇氯甲酸酯的活化在圆底烧瓶中，按顺序加入胆固醇氯甲酸酯（chol-cl）、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc），在一定温度下搅拌一段时间后得到无色澄清溶液a；（2）抗蛋白质的两亲性胆固醇壳聚糖酯的合成（chcs）在三口烧瓶中，加入壳聚糖，随后加入甲磺酸，通氮气除氧气后封口，搅拌至壳聚糖完全溶解，在氮气保护下，逐滴加入步骤（1）制备的溶液a，反应过程不断有沉淀析出，反应在一定温度条件下搅拌一定时间。反应结束后将上述混合物倒入大量沉淀剂中，产物经离心后洗涤，再将所得的洗涤产物通过溶解-沉淀方式进行提纯后进行抽滤，冷冻干燥得到米白色固体状的胆固醇壳聚糖酯（chcs）；（3）利用langmuir技术研究chcs在空气/水界面单分子膜行为。用微量进样器移取50-300µl1.0mg/ml的chcs氯仿溶液，在langmuir-blodgett（lb）槽体的正上方缓慢滴加至亚相水面上，使其更好的铺展在水面上。等待5-30min至成膜分子全部扩散且氯仿挥发后，手动归零天平压力，设置滑障速度为10-200cm2/min，压缩滑障，得到有序密集排列的单分子膜的表面压（π）与平均分子面积（a）等温曲线。π-a等温曲线显示chcs单分子膜的压缩过程表面压呈现先缓慢增加到急剧增加，而后下降的变化过程。chcs单分子膜成膜性能良好，能在水相上稳定存在，从而说明chcs具有良好的两亲性。（4）抗蛋白质吸附实验将一定量cs或步骤（2）制得的chcs配制成一定浓度的溶液，利用匀胶机在基板上涂膜，涂层干燥及预处理后备用；将预处理后的涂层浸入不同浓度的牛血清白蛋白（bsa）溶液中，在一定条件下，吸附一段时间后，利用bca法测定吸附前后蛋白质溶液浓度的变化，根据浓度计算出蛋白质的吸附量，进而计算抗蛋白质吸附率。在本发明方法中，步骤（1）中所述的胆固醇氯甲酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐摩尔比为：1:1～3，n,n-二甲基甲酰胺加入量为50～200ml，反应条件为25～50℃，搅拌2～6h得到无色澄清溶液a。在本发明方法中，步骤（2）中所述的壳聚糖与甲磺酸溶剂比例为：0.1g:5～30ml；反应条件为25～80℃，搅拌12～120h。其中所述的粗产物提纯用到的沉淀剂是水，所得的洗涤产物通过氯仿溶解-甲醇沉淀的方式提纯后进行抽滤，冷冻干燥。步骤（1）中所述的胆固醇氯甲酸酯、步骤（2）中所述的壳聚糖重复单元摩尔比为：0.01～7:1。在本发明方法中，步骤（4）中所述的将一定量cs或步骤（2）制得的chcs配制成一定浓度的溶液是用溶剂配制成浓度为1～50mg/ml的溶液，所述溶剂为水、醋酸、四氢呋喃、氯仿、乙醇中一种或多种组合；其中所述的基板涂覆条件是：干燥洁净的20×20mm规格的基板，转速为1000～5000r/min，时间为20～100s，cs和chcs用量50～1000µl；其中所述的涂层的预处理的步骤是：将干燥好的csch或cs涂层或空白洁净的基板分别用10～100%的酒精浸泡1～10min，目的在于打开蛋白质吸附通道，最大程度的吸附蛋白质，再用蒸馏水冲洗去除残留的酒精，然后浸入到1～10ml0.01～0.2m、ph=7.0pbs溶液中浸泡1～5h；其中所述的不同浓度的蛋白质溶液是用pbs与蛋白质配制的，不同浓度的蛋白质浓度在0.01～20mg/ml，蛋白质溶液需现配现用；其中所述的在一定条件下，吸附一段时间是在20～40℃时，将预处理好的csch或cs涂层或空白洁净的基板分别浸泡在1～10ml蛋白质溶液中进行蛋白质吸附，1～5h后取出试样；其中所述的bca法测样品蛋白质浓度，是在酶标仪或紫外可见分光光度计上测得，测定蛋白质溶液在562nm处的吸光值。本发明对应的一种非两亲性壳聚糖抗蛋白质吸附涂层即未改性的壳聚糖涂层。本发明提供的利用两亲性壳聚糖衍生物抗蛋白质吸附的方法，其优点在于：（1）本发明以壳聚糖为功能高分子，经氨基保护后分子链中羟基与胆固醇氯甲酸酯反应引入疏水基团，合成胆固醇壳聚糖酯（chcs），既保留氨基的活性又赋予壳聚糖两亲性。chcs合成示意图见图1，与传统方法相比，该法能保护氨基同时减缓反应剧烈程度，使分子量分布均匀，膜性能提高；（2）本发明结合壳聚糖具有丰富的亲水基团氨基和羟基，易进行化学改性，且安全无毒、来源丰富、抗酸碱的优点和胆固醇氯甲酸酯易与羟基反应的特性提出一种简单，易与控制的方法，合成一种两亲性壳聚糖衍生物，并用于抗蛋白质研究；（3）两亲性聚合物由于具有亲水性以及具有可发生微相分离的两亲性特殊结构，所以能够有效地抵抗蛋白质的吸附，作为抗蛋白质吸附材料越来越引起科学研究者的关注。本发明通过在壳聚糖上引入疏水基团，改善了膜的两亲性能，使其抗蛋白质能力增强；（4）实验改性方法简单，操作易行，原料易得，成本低廉，有很好的应用前景。本发明用于抗蛋白质吸附材料的制备和应用研究。附图说明图1为本发明所制备的一种两亲性壳聚糖衍生物chcs合成示意图。图2为本发明所制备的一种两亲性壳聚糖衍生物chcs的傅里叶红外光谱图。图3为本发明所制备的一种两亲性壳聚糖衍生物chcs的核磁碳谱图。图4为本发明所制备的一种两亲性壳聚糖衍生物chcs单分子膜的表面压（π）-平均分子表观面积（a）等温曲线。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述本发明利用两亲性聚合物抗蛋白质的机理，改性得到一种两亲性壳聚糖衍生物，与传统的抗蛋白质材料比较，两亲性聚合物抗蛋白质材料，作为一种新型的抗生物污染材料展现了其独特的优势，一方面解决了常规的亲水性抗污材料在水环境下的不稳定性，从而不需要通过复杂的化学键结合的方法将分子链固定；另一方面可以通过改性的方法在一些不抗污染的疏水材料表面接枝一段亲水基团，从而扩大了许多材料的使用范围，目前已成为抗蛋白质吸附材料研究的前沿领域。实施例1（1）胆固醇氯甲酸酯的活化在250ml圆底烧瓶中，按顺序加入1.38g胆固醇氯甲酸酯（chol-cl）、100mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)以及0.60g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc），反应在45℃下搅拌2h后得到无色澄清溶液a；（2）合成抗蛋白质的两亲性胆固醇壳聚糖酯（chcs）在250ml三口烧瓶中，加入1.0g壳聚糖，随后加入35ml甲磺酸，通氮气除氧气后封口，搅拌至壳聚糖完全溶解，在氮气保护下，逐滴加入步骤（1）制备的溶液a，反应过程不断有沉淀析出，反应在45℃下搅拌72h。反应结束后将上述混合物倒入大量冰水中，产物经离心后洗涤，再将所得的洗涤产物通过氯仿溶解-甲醇沉淀方式进行提纯后进行抽滤，冷冻干燥得到米白色固体状的胆固醇壳聚糖酯（chcs）。chcs对水的静态接触角为89.02°。结合红外光谱图（图2）和核磁碳谱图（图3）证实两亲性壳聚糖chcs成功合成。实施例2（1）胆固醇氯甲酸酯的活化在250ml圆底烧瓶中，按顺序加入2.76g胆固醇氯甲酸酯（chol-cl）、100mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)以及1.20g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc），反应在45℃下搅拌2h后得到无色澄清溶液a；（2）合成抗蛋白质的两亲性胆固醇壳聚糖酯（chcs）在250ml三口烧瓶中，加入1.0g壳聚糖，随后加入35ml甲磺酸，通氮气除氧气后封口，搅拌至壳聚糖完全溶解，在氮气保护下，逐滴加入步骤（1）制备的溶液a，反应过程不断有沉淀析出，反应在45℃下搅拌72h。反应结束后将上述混合物倒入大量冰水中，产物经离心后洗涤，再将所得的洗涤产物通过氯仿溶解-甲醇沉淀方式进行提纯后进行抽滤，冷冻干燥得到米白色固体状的胆固醇壳聚糖酯（chcs）。chcs对水的静态接触角为91.89°。实施例3（1）胆固醇氯甲酸酯的活化在250ml圆底烧瓶中，按顺序加入5.49g胆固醇氯甲酸酯（chol-cl）、100mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)以及2.40g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc），反应在45℃下搅拌2h后得到无色澄清溶液a；（2）合成抗蛋白质的两亲性胆固醇壳聚糖酯（chcs）在250ml三口烧瓶中，加入1.0g壳聚糖，随后加入35ml甲磺酸，通氮气除氧气后封口，搅拌至壳聚糖完全溶解，在氮气保护下，逐滴加入步骤（1）制备的溶液a，反应过程不断有沉淀析出，反应在45℃下搅拌72h。反应结束后将上述混合物倒入大量冰水中，产物经离心后洗涤，再将所得的洗涤产物通过氯仿溶解-甲醇沉淀方式进行提纯后进行抽滤，冷冻干燥得到米白色固体状的胆固醇壳聚糖酯（chcs）。chcs对水的静态接触角为96.52°。实施例4（1）胆固醇氯甲酸酯的活化在250ml圆底烧瓶中，按顺序加入8.23g胆固醇氯甲酸酯（chol-cl）、150mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)以及3.60g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc），反应在45℃下搅拌2h后得到无色澄清溶液a；（2）合成抗蛋白质的两亲性胆固醇壳聚糖酯（chcs）在250ml三口烧瓶中，加入1.0g壳聚糖，随后加入35ml甲磺酸，通氮气除氧气后封口，搅拌至壳聚糖完全溶解，在氮气保护下，逐滴加入步骤（1）制备的溶液a，反应过程不断有沉淀析出，反应在45℃下搅拌72h。反应结束后将上述混合物倒入大量冰水中，产物经离心后洗涤，再将所得的洗涤产物通过氯仿溶解-甲醇沉淀方式进行提纯后进行抽滤，冷冻干燥得到米白色固体状的胆固醇壳聚糖酯（chcs）。chcs对水的静态接触角为97.59°。（3）胆固醇壳聚糖酯langmuir膜的制备采用langmuir技术，两亲性物质可以在空气/水界面形成langmuir膜，且随着单层膜的形成水相表面压发生变化。根据langmuir膜天平记录的表面压（π）与平均分子面积（a）等温曲线，可动态研究在亚相上两亲性物质的单分子膜行为。具体单分子膜的形成如下，用微量进样器移取100µl1.0mg/ml的chcs氯仿溶液，在lb槽体的正上方缓慢滴加至亚相水面上，使其更好的铺展在水面上。等待30min至成膜分子全部扩散且氯仿挥发后，手动归零天平压力，设置滑障速度为50cm2/min，压缩滑障，得到有序密集排列的单分子膜的π-a等温曲线如图4所示。从π-a等温曲线可以看出，单分子膜的压缩过程呈现出明显的气态膜、液态膜和固态膜三个阶段的物理状态，膜表面压从缓慢增加、急剧增加到下降，塌陷压为47.25mn/m，相应平均单分子层极限面积（a*）是310.30cm2。表明chcs单分子膜成膜性能良好，能在水相上稳定存在，从而说明chcs具有良好的两亲性。实施例5（1）胆固醇氯甲酸酯的活化在500ml圆底烧瓶中，按顺序加入10.98g胆固醇氯甲酸酯（chol-cl）、200mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)以及4.80g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc），反应在45℃下搅拌2h后得到无色澄清溶液a；（2）合成抗蛋白质的两亲性胆固醇壳聚糖酯（chcs）在500ml三口烧瓶中，加入1.0g壳聚糖，随后加入35ml甲磺酸，通氮气除氧气后封口，搅拌至壳聚糖完全溶解，在氮气保护下，逐滴加入步骤（1）制备的溶液a，反应过程不断有沉淀析出，反应在45℃下搅拌72h。反应结束后将上述混合物倒入大量冰水中，产物经离心后洗涤，再将所得的洗涤产物通过氯仿溶解-甲醇沉淀方式进行提纯后进行抽滤，冷冻干燥得到米白色固体状的胆固醇壳聚糖酯（chcs）。chcs对水的静态接触角为98.12°。实施例6（1）胆固醇氯甲酸酯的活化在500ml圆底烧瓶中，按顺序加入13.73g胆固醇氯甲酸酯（chol-cl）、250mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)以及6.0g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc），反应在45℃下搅拌2h后得到无色澄清溶液a；（2）合成抗蛋白质的两亲性胆固醇壳聚糖酯（chcs）在500ml三口烧瓶中，加入1.0g壳聚糖，随后加入35ml甲磺酸，通氮气除氧气后封口，搅拌至壳聚糖完全溶解，在氮气保护下，逐滴加入步骤（1）制备的溶液a，反应过程不断有沉淀析出，反应在45℃下搅拌72h。反应结束后将上述混合物倒入大量冰水中，产物经离心后洗涤，再将所得的洗涤产物通过氯仿溶解-甲醇沉淀方式进行提纯后进行抽滤，冷冻干燥得到米白色固体状的胆固醇壳聚糖酯（chcs）。chcs膜对水的静态接触角为106.75°。实施例7将实施例1或实施例2或实施例3或实施例4或实施例5或实施例6制得的不同取代度的chcs配制成15.0mg/ml的氯仿溶液备用。用移液枪取100µl上述备用的溶液，加在清洁干净的玻片中心；设定好涂膜机参数（speed1=500r/min，timer1=15s；speed2=2000r/min，timer2=50s）。把玻片置于涂膜机的特定支架上，启动涂膜机，旋转涂膜。在50℃干燥5h后，在另一面以相同条件涂膜。制得的涂层被分别标记为chcs-1、chcs-2、chcs-3、chcs-4、chcs-5和chcs-6。实施例8将壳聚糖(cs)溶解在2%的醋酸溶液中配制成15.0mg/ml的溶液备用，用移液枪取100µl上述备用的溶液，加在清洁干净的玻片中心；设定好涂膜机参数（speed1=500r/min，timer1=15s；speed2=2000r/min，timer2=50s）。把玻片置于涂膜机的特定支架上，启动涂膜机，旋转涂膜。在50℃干燥5h后，在另一面以相同条件涂膜。制得的涂层试样被标记为cs-0。实施例9将实施例7中的一系列csch涂层或实施例8中的cs-0涂层或空白洁净的玻片分别用50wt%的酒精浸泡1min，再用蒸馏水冲洗去除残留的酒精，然后浸入到3ml0.01m、ph=7.0pbs溶液中浸泡3h；最后将这些预处理后的涂层或玻璃片浸泡在2ml1.0mg/mlbsa溶液中(蛋白质溶液是用0.01m、ph=7.0pbs配制，现配现用)，在25℃下，吸附3h后，利用bca法，在酶标仪上测定蛋白质溶液在562nm处的吸光值。根据工作曲线从吸光值的大小得到吸附前后蛋白质的浓度，根据浓度变化计算出蛋白质的吸附量，进一步计算出抗蛋白质吸附率。试样的抗蛋白质吸附率值列于下表；no.cs-0chcs-1chcs-2chcs-3chcs-4chcs-5chcs-6抗蛋白质吸附率44.6%52.1%60.1%67.3%80.3%31.8%28.1%实施例10将实施例7中制得的一系列csch涂层或实施例8中的cs-0涂层或空白洁净的玻璃片分别用50wt%的酒精浸泡1min，再用蒸馏水冲洗去除残留的酒精，然后浸入到3ml0.01m、ph=7.0pbs溶液中浸泡3h；最后将这些预处理后的涂层或玻璃片浸泡在2ml0.5mg/mlbsa溶液中(蛋白质溶液是用0.01m、ph=7.0pbs配制，现配现用)，在25℃下，吸附3h后，利用bca法，在酶标仪上测定蛋白质溶液在562nm处的吸光值，根据工作曲线从吸光值的大小得到吸附前后蛋白质的浓度，根据浓度计算出蛋白质的吸附量，进而计算抗蛋白质吸附率。试样的抗蛋白吸附率值列于下表；no.cs-0chcs-1chcs-2chcs-3chcs-4chcs-5chcs-6抗蛋白质吸附率51.7%77.3%78.8%79.8%91.6%26.2%19.5%将实施例9或实施例10中所列的系列两亲性涂层抗蛋白质吸附率值之间对比，发现实施例9或实施例10中壳聚糖(亲水性)和胆固醇氯甲酸酯取代度较高的壳聚糖衍生物涂层（相对胆固醇氯甲酸酯取代度较低的壳聚糖衍生物涂层呈疏水性）吸附蛋白质量都比较多，抗蛋白质吸附率低。而通过调节亲水性和疏水性基团或链段的比例，使得壳聚糖衍生物中胆固醇基团取代度适中，此两亲性壳聚糖衍生物（即控制两亲性壳聚糖衍生物的两亲性在合理的范围内）吸附的蛋白质明显减少，抗蛋白质吸附率极高（如chcs-4）。抗蛋白质吸附机理：蛋白质分子由于特殊的化学结构和复杂的组成，极易吸附在疏水性材料表面。当疏水区域足够小，与蛋白质分子疏水区域相当，即在表面形成一层亲疏水基团交替排列的形式，对蛋白质形成竞争吸附和排斥的作用，会抑制蛋白质分子向材料表面靠近和吸附，调控涂层表面的亲疏水面积大小，可以探究最佳的抗蛋白质效果。上述的具体实施方式是对本发明申请的进一步详细说明，但本发明权利要求保护的范围并不局限于实施方式中所描述的范围，凡采用等同替换或等效变形的技术方案，均落在本发明权利要求的保护范围。当前第1页12